云南烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)病原鉴定及其融合群研究

2016年云南省普洱市和临沧市烟草种植区大面积发生叶部病害,经鉴定为烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn),此病为云南烟区首次发现。广泛采集2个市的烟草靶斑病病叶标本59份,采用常规组织分离法获得58个菌株,将所获菌株分别与立枯丝核菌标准融合群菌株AG-1-IA、AG-2-1、AG-3、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8和AG-9进行载玻片对峙培养,并进行菌丝融合观察,结果表明:58个菌株均属于立枯丝核菌AG-3标准融合群,且不与其他标准融合群发生融合反应。随机选取云南省6个地区各1个代表性菌株,以待测菌株的基因组DNA为模板,利用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1和ITS4对病菌rDNA ITS序列进行PCR扩增,扩增产物序列在Gen Bank中进行BLAST同源性检索比对。应用MEGA 6.06软件和NeighborJoining法,分别计算遗传距离及构建系统发育进化树分析亲缘关系。基于5.8S rDNA-ITS区序列的系统发育树进一步分析,结果表明,Rhizoctonia solani菌株的ITS序列可明显的分为2个支系,同一菌株的不同ITS序列可分别存在不同的分支中,但所有菌株的序列均隶属相同的融合群即AG-3,且隶属相同融合群的不同菌株之间其序列的一致性可高达99%~100%。

烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)致病力分化研究

采用温室离体叶片接种法,以平均病斑直径(AD)为抗性评价标准,选用3个抗感反应不同的烟草品种对18株不同地区的烟草靶斑病菌的致病力进行了测定。结果表明:不同地区来源的烟草靶斑病菌菌株间致病力存在明显差异,划分为3个致病类型:致病型I,属于强致病类型,包含了4个菌株,YC-9和YMC-2,分别来源于铁岭市开原县营场乡和丹东市宽甸县杨木川乡,占供试菌株的22.2%;致病类型Ⅱ,中等致病类型,分别来源于铁岭市开原市和西丰县及丹东市宽甸县和风城市大堡镇,占61.1%;致病类型Ⅲ,属于弱致病类型,包含LF-2、QYS-3和QYS-5共3个菌株,来源于铁岭市开原县林丰乡和丹东市宽甸县青椅山乡,占16.7%。辽宁省烟草靶斑病菌以致病类型Ⅱ为优势种群,致病类型分布与地区来源无明显相关性。

烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)SRAP-PCR体系建立及优化

采用烟草靶斑病菌YC-9,LJT-8和QYS-7为DNA模板,初步筛选SRAP引物组合;采用L16(45)正交试验设计,对烟草靶斑病菌的SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs,Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板浓度等5个因素进行优化试验。结果表明:共筛出13对扩增条带清晰且多态性好的引物组合;烟草靶斑病菌的最佳SRAP反应体系为Mg2+浓度2.0 mmol/L、dNTP浓度200μmol/L、Taq DNA聚合酶0.8 U、引物浓度140 mmol/L、模板DNA 20 ng及1×PCR buffer,反应总体积为20μL;各因素对SRAP-PCR扩增反应结果影响的差异较大,依次为Taq DNA聚合酶>引物>Mg2+>dNTPs=模板DNA。

烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)细胞壁降解酶活性分析及其致病作用

为揭示烟草靶斑病菌细胞壁降解酶的致病机理,进行了烟草靶斑病菌细胞壁降解酶活性变化、产酶条件及对叶片损伤作用的研究.结果表明：烟草靶斑病菌在烟草活体内、外均可产生果胶酶及纤维素酶,其中烟草组织活体外以多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性最高,而在烟草活体内羧甲基纤维素酶（Cx）和β-葡萄糖苷酶活性最高,且强致病力菌株的产酶能力强于弱致病力菌株;产酶条件研究表明,培养10d产生的Cx和β-葡萄糖苷酶的活性最强,而培养12d产生的PG、PMG、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）和果胶甲基反式消除酶（PMTE）的活性最强;最适宜产生CWDEs的条件为250下,pH5～6连续黑暗的静止培养环境;烟草靶斑病菌产生的细胞壁降解酶可导致烟草叶片明显受损,其损伤作用大小表现为混合酶明显高于单一酶,且果胶酶对烟草叶片的损伤作用高于纤维素酶.

烟草靶斑病菌(Rhizoctoniasolani)粗毒素的生物活性及理化性质

为揭示烟草靶斑病菌毒素的致病机理,进行了烟草靶斑病菌毒素的分离、纯化和生物活性测定方法及理化特性研究。结果表明:经分离纯化获得了烟草靶斑病菌的毒素。该毒素可以损伤离体叶片,抑制种子萌发和胚根的生长,并且可致使幼苗萎蔫,离体叶片针刺法最适宜毒素的生活性测定。烟草靶斑病菌毒素具有热与光稳定性,较耐储藏,是一类极性化合物,活性物属非蛋白类物质。

烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)ISSR反应体系的优化及遗传多样性分析

以烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)基因组DNA为模板,采用单因素和正交设计L_(16)(4~5)相结合的方法对影响ISSR-PCR反应的主要因子进行优化,并对采自东北三省烟区的20个烟草靶斑病菌菌株进行ISSR分析,建立了适宜于病菌的ISSR分子标记的最佳反应体系,即20μL的反应体系中含有模板DNA 30ng,Mg^(2+)浓度2.0mmol·L^(-1),d NTP浓度0.20 mmol·L^(-1),Taq酶1.0U,引物浓度0.4μmol·L^(-1)。利用优化的反应体系从20个ISSR引物中筛选出13个多态性和重复性好的引物,对20个烟草靶斑病菌菌株进行ISSR分析,共扩增出132条带,多态条带比率为73.48%,在相似系数0.74处将其划分为3个类群,其中LTL-7、HLK-1、HBX-2、HBX-4、LFC-9、LTL-5、LTL-9和JLH-1共8个菌株被划分在IGⅠ中;IGⅡ中包括LTL-6、LKD-8、HLK-3、LTL-115、LTL-2、LFC-4和LTL-8共7个菌株;其余5个菌株分别为LTL-66、LTL-111、HLK-4、JLH-3和LTL-22被划分到IGⅢ中。分析结果表明ISSR遗传聚类组群与菌株的地理来源具有一定的相关性,而与菌株的致病性无明显的相关性。

噻呋酰胺与吡唑醚菌酯复配对烟草靶斑病菌的抑制活性及对烟草靶斑病的室内防效

由立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的靶斑病是近年来烟草主要叶部病害之一,严重降低了烟叶的产量和品质。目前生产中登记用于防治烟草靶斑病的药剂仅有井冈霉素,且该药剂对病害的田间治疗效果较差。为筛选对烟草靶斑病具有优良防效的化学药剂,本研究采用菌丝生长速率法建立了立枯丝核菌对噻呋酰胺和吡唑醚菌酯的敏感性基线,发现两者对立枯丝核菌菌丝生长均有较强的抑制作用。通过联合毒力测定发现两者复配后均表现为相加或增效作用,其中,噻呋酰胺与吡唑醚菌酯按质量比1:1复配,增效作用最明显,增效系数达2.5以上,可显著抑制病原菌菌核形成。采用喷雾接种法测定了该复配比作为保护剂和治疗剂使用时对烟草靶斑病的防效,发现其具有优异的室内防效。本研究结果表明,噻呋酰胺与吡唑醚菌酯按质量比1:1复配在田间防治烟草靶斑病中具有较好的应用前景。

广西烟草立枯病菌和靶斑病菌菌丝融合群初步分析

为了明确广西烟草立枯病菌和靶斑病菌的菌丝融合群,从广西发病烟草植株上分离了2株烟草立枯病菌菌株和3株靶斑病菌菌株。经形态特征和细胞核染色观察发现,这5株菌株均属于多核立枯丝核菌。依据供试菌株与标准菌株的菌丝融合反应,发现广西烟草立枯病菌和靶斑病菌均包含AG-2和AG-4两个菌丝融合群。进一步分析5个菌株的r DNA-ITS序列,初步明确这2种病原菌包括AG-4 HG-I和AG-2-2 IIIB 两个菌丝融合群,与菌丝融合反应分析结果相吻合。首次在国内从烟草靶斑病组织上分离到AG-2 和AG-4 融合群。

烟草靶斑病菌毒素对烟草防御酶及丙二醛含量的影响

采用烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)粗毒素原液处理6叶期烟草幼苗,测定12、24、36、48、60、72h后烟草叶片中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性和丙二醛(MDA)含量。结果表明,经烟草靶斑病菌粗毒素处理后的烟草POD、PAL的活性及MDA含量都高于对照,并呈现一定的波动性;PPO和CAT先升高后下降,始终高于对照;而SOD酶的活性表现为持续下降。

湖北省烟草靶斑病病原鉴定及其菌丝融合群遗传分化研究

2020—2021年湖北烟区爆发新型烟草叶部病害,本研究对病原菌进行分离培养、形态观察、镜检菌丝和科赫法则验证,并提取30个菌株的DNA使用通用引物ITS1/ITS4进行rDNA-ITS序列的PCR扩增,及MEGA-X软件进行基因序列比对及系统发育树构建,同时以Rs1F2/Rs2R1为引物,进行30个菌株的r DNA-ITS基因的PCR专化性鉴定。结果表明,该病害病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn),30个菌株序列都隶属于R. solani AG-3融合群且均具有AG-3融合群所特有的504 bp片段。因此,确定该病害为烟草靶斑病。这是首次从湖北省烟草产区分离鉴定到该病菌。

烟草靶斑病LFD-RPA快速检测方法的建立

烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增技术相关引物RsRPA-F3/R3,建立了一种靶斑病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。该方法能够在37℃,15 min内特异性地检测到R.solani(1.40×10^(2) copies/µL)质粒DNA,与常规PCR灵敏度一致。在田间烟草靶斑病实时检测中,准确率达95.83%。本方法具有快速、简单、可视化等特点,为烟草靶斑病菌的田间快速诊断提供了技术支撑。

湖南烟草靶斑病的病原鉴定及分子检测

2019至2020年,在湖南省郴州、永州、湘西和常德烟区发生了一种严重的叶部病害,表现为叶部出现圆形或不规则黄褐色病斑,有不规则同心纹,病斑周围可见黄绿色晕圈,后期易破裂穿孔。经组织分离、形态学观察、分子鉴定以及柯赫氏法则验证,确定该病害为烟草靶斑病,病原为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kola)。在此基础上,以烟草靶斑病菌rDNA–ITS序列为靶标,设计特异性引物Rs–1,建立了特异性针对靶斑病菌的PCR检测体系,从烟草病斑处检测烟草靶斑病菌。

贵州烟区靶斑病病原菌的融合群研究与戊唑醇室内毒力测定

为了准确鉴定贵州烟区靶斑病的病原,明确其融合群划分,初步测定低毒杀菌剂戊唑醇的室内毒力;从贵州开阳暴发靶斑病严重的烟田分离纯化病原菌菌株,开展显微镜形态观察和ITS分子标记测序,进行回接致病力分析,然后根据贵州菌株与参考立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌株ITS序列的系统发育分析,确定融合群划分,最后开展7个浓度的戊唑醇培养基抑制菌丝生长的试验,并根据抑制率计算半致死率(EC_(50));共在贵州开阳烟区获得靶斑病病原菌纯培养菌株15株,在显微镜下可以清楚看到菌丝的“T”型分枝结构,菌株长度约700 bp的ITS基因片段与GenBank数据库上的立枯丝核菌参考序列存在高相似性,回接健康烟苗也可以产生症状相似的坏死病斑,贵州菌株全部与融合群AG-3的参考序列聚集在一起,戊唑醇对15株立枯丝核菌菌株的EC_(50)均小于0.003 mg/mL。由此可知,开阳等贵州烟区近年暴发的叶斑类病害确定为靶斑病,病原菌为立枯丝核菌,属于国内大多数烟区报道的融合群AG-3,戊唑醇对其具有良好的防效,可以开展后续大田试验。

烟草靶斑病病原鉴定及室内药剂毒力测定

为明确烟草靶斑病病原菌的分类地位并筛选出防控药剂,本研究对贵州省开阳县烟草靶斑病病叶进行分离纯化,通过致病性测定、形态学观察、生物学特性以及rDNA-ITS分析鉴定,确定了烟草靶斑病病原菌为立枯丝核菌Rhizoctoniz solani。研究发现该病原菌最适生长温度范围为25~30℃,最适pH值为6,蔗糖、蛋白胨分别是较好的碳、氮源。以28%井冈霉素为对照药剂,供试7种杀菌剂均对该病原菌有抑制效果,其中0.03%四霉素抑菌活性最高,EC 50为0.04 mg/L,其次是80%戊唑醇,EC 50为0.44 mg/L。试验结果为烟区有效控制烟草靶斑病的发生蔓延提供依据。

烟草靶斑病病原生物学与综合防控措施研究进展

烟草靶斑病于2006年在辽宁丹东烟区被发现之后,在我国许多地方被报道,影响了烟叶生产,造成了经济损失。本文从烟草靶斑病的识别鉴定、病原生物学、发生流行规律与综合防控措施等4个方面综述了烟草靶斑病研究进展,旨在为烟草靶斑病的快速准确识别与高效绿色防控提供参考。

烟草靶斑病菌菌丝融合群及ITS序列分析

烟草靶斑病是2006年我国新报道发生的一种叶部病害，其病原的无性世代为立枯丝核菌（Rhizoctonia solaniKfihn），有性世代为瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk）。该病菌主要危害叶部形成病斑，对烟草的产量和品质影响显著，目前该病害主要分布在辽宁省丹东和铁岭地区，并呈现出迅速蔓延趋势。烟草靶斑病最早由巴西报道，此后，哥斯达黎加、美国、南非和津巴布韦也相继发生。

重庆烟区烟草靶斑病病原菌鉴定及菌丝融合群分析

为明确重庆各烟区烟草靶斑病的病原菌种类与病害发生情况,对重庆市黔江区水市乡、涪陵区武陵山乡、武隆区接龙乡、万州区孙家镇、酉阳土家族苗族自治县和彭水苗族土家族自治县烟草靶斑病病害发生进行了调查,并通过组织分离法对典型发病叶片的病原菌进行分离、纯化,观察纯化菌株在PDA培养基上的形态特征,采用菌丝块接种法测定纯化菌株的致病性,通过玻片对峙法观察其与标准菌株的菌丝融合情况,并使用通用引物ITS1/ITS4对13个纯化菌株的rDNA-ITS序列进行扩增,使用MEGA 11软件对扩增序列进行分析比对,构建系统发育树。结果表明,纯化菌株的形态特征与立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)一致,且对烟苗叶片具有致病力;菌丝融合群测定发现,纯化菌株与立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-3融合群的菌丝完全融合;rDNA-ITS序列Blast比对及系统发育树分析显示,其与立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-3融合群以97%的支持率聚于同一分支上。因此,确定重庆烟区烟草靶斑病的病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-3融合群。