Rhizopus chinensis 12^#发酵产生纤溶酶的分离提纯

分离自南方小酒药的华根霉12#(Rhizopuschinensis12#)以豆粕和麸皮为原料固体发酵可产生多种纤溶活性组分.采用饱和度40%～70%的硫酸铵溶液分步盐析、OctylSepharoseFastFlow疏水层析、Q SepharoseHighPerformance离子交换层析和SephacrylS 100凝胶层析方法对活性组分进行分离提纯,得到电泳纯的纤溶酶.SDS PAGE方法测定该酶相对分子质量为18000,凝胶过滤方法测定相对分子质量为16600,表明该酶由单亚基组成.

根霉12^#发酵产生纤溶酶的酶学性质

溶栓疗法是血栓性疾病安全有效的治疗手段 ,开发新型纤溶酶具有实际应用意义。分离自南方小酒药的根霉 12 #以豆粕和麸皮为原料可产生纤溶酶。已采用盐析 ,疏水层析、离子交换层析和凝胶层析方法对纤溶酶分离提纯。提纯的纤溶酶比活力 2 14 3u mg(尿激酶单位 ) ,有直接溶解血栓和激活纤溶酶原的双重溶栓作用 ,降解纤维蛋白α、β和γ肽链速度快 ;最适作用温度 4 5℃ ,适宜作用pH范围 6 . 8～ 8. 8;等电聚焦方法测定该酶等电点 8 .5± 0. 1;只分解生色底物N_Succinyl_Ala_Ala_Pro_Phe_pNA ,其米氏常数Km 为 0 .2 3mmol L ,酶转换数Kcat为 16 36s- 1 ;Molish实验和甲苯胺蓝实验均证明该酶为糖蛋白 ,地衣酚_硫酸法测得该酶含糖量 4 70 % ;EDTA、PMSF、PCMB对该纤溶酶有抑制作用 ,说明活性中心含有巯基、金属和丝氨酸 ;N端 12个氨基酸序列为NH2 _Ser_Val_Ser_Glu_Ile_Gln_Leu_Met_His_Asn_Leu_Gly,与其它生物来源的纤溶酶相比较没有同源性。根霉 12 #产生的纤溶酶为新型纤溶酶 ,有希望开发成溶栓药物。

产纤溶酶菌株根霉12^#的诱变育种及固态发酵培养基的优化

以产纤溶酶的菌株根霉 12 # 为出发菌株 ,对其进行紫外线 氯化锂复合诱变 ,筛选到74株制霉素抗性突变株。所有抗性突变株经进一步固态发酵筛选 ,获得了 4株稳定高产纤溶酶的正突变株 ,其纤溶酶产量分别比出发菌株提高 3 2 9%、2 1 5 %、2 2 3 %和 18 0 %。以其中的 1株为菌种 ,研究了固态发酵产生纤溶酶的培养基组成。采用单因素试验、均匀设计方法对固态发酵培养基的碳源、氮源、碳氮比、初始pH、加水量、无机盐加量进行了优化。结果表明 ,实验范围内根霉 12 # 固态发酵产生纤溶酶的适宜培养基组成为 :m (麸皮 )∶m (豆粕 )=1∶2 ,初始 pH5 0 ,加水量 0 75mL/g物料 ,MnSO4·H2 O和 (NH4) 2 SO4加量分别为 0 2 5 %和1 42 % (对物料 )。优化条件下的固态发酵纤溶酶产量平均达 744 5 7U/g物料。

华根霉固态发酵产纤溶酶的工艺优化和初步提纯

采用华根霉TK317(Rhizopus chinensis)进行固态放大发酵实验,发酵培养基初始含水量为0.75 mL/g,固体发酵罐中湿度控制在70%,发酵前期30 h通风量为640 L/min,后30 h 通风量变为560 L/min,酶活力最高,达到706.3 U/g干基。研究并确定了中空纤维超滤浓缩,硫酸铵盐析的分离提取工艺,经过纯化,酶的比活力达23.32 U/mg,比浸提液提高11.05倍,酶活力回收率为70.2%。

根霉12^#发酵生产纤溶酶的分离纯化

本文研究了根霉12#固体发酵产生纤溶酶的特性,并通过SephadexG-75凝胶过滤对根霉12#纤溶酶进行分离纯化,最后用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳验证纤溶酶的存在。