匍枝根霉TP-02内切葡聚糖酶基因eg2的克隆表达及功能分析

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到内切葡聚糖酶基因eg2,在大肠杆菌BL21中成功表达,通过对其结构功能进行初步分析,并对EGⅡ的纤维素结合模块CBM1及催化结构域GH45区进行突变研究。结构分析表明:N39S可影响CBM1亲水平面的形成,V136D及E260D对GH45活性中心的改变较大。突变株的发酵特性显示,N39S可缩短达到峰值的时间,V136D及E260D可显著提高酶活。其中,突变株EGⅡ-F在发酵21 h后,酶活达到最高为1.321 IU/mL,比突变前提高了82.7%。

匍枝根霉β-葡萄糖苷酶BGLIII关键位点的结构功能

从匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer)基因组DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶bgl3全长基因,并在大肠杆菌BL21中实现表达。通过对β-葡萄糖苷酶的生物信息学分析,确定其与底物作用过程中的关键氨基酸为Trp127。对该位点进行突变研究,结果显示:突变为不带侧链的Ala时,酶活降低20.8%;突变为具有相同苯环侧链的Phe时,酶活相差不大;突变为带有非苯环长链的Leu时,酶活提高34.07%。Leu的长链在维持原有活性中心构象的基础上,与酶解产物葡萄糖的疏水作用增强,从而提高酶与底物结合效率。即127位氨基酸的空间构象对BGLIII活性中心的结构功能有显著影响。

色氨酸W129在匍枝根霉内切葡聚糖酶EGⅡ降解纤维素过程中的作用

通过对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)内切葡聚糖酶EGII进行结构功能分析,发现其活性中心入口处的色氨酸W129在水解纤维素的过程中起着关键作用。对该位点进行定点突变(W129A),并研究了它对EGII和催化区(CD)的影响。经原核表达及纯化,获得目的蛋白EGII-W129A和CD-W129A。酶学特性研究结果显示,重组蛋白的比酶活、kcat和kcat/Km均低于EGII和CD,比酶活分别下降了23.8%和35.7%,同时Km值均有所提高。W129A导致酶与底物的亲和力和催化效率下降,使酶活力降低的原因主要是其减弱了活性中心入口处纤维素链的"载入"效率,即Trp129在EGII水解纤维素过程中起到加载纤维素链的重要作用。