脑出血模型大鼠Rho激酶Ⅱ的表达及其与凝血酶的关系

目的:观察大鼠脑出血(ICH)后不同时间点血肿周围组织Rho激酶Ⅱ(ROCKⅡ)表达及其与凝血酶的关系。方法:180只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(S组)、ICH组和阿加曲班组(ICH+A组)。ICH组和ICH+A组采用自体血注入法建立大鼠ICH模型,ICH+A组于造模后颅内原位注入阿加曲班注射液(0.5 mg/L);S组在相同位点2次注入等容量0.9%氯化钠液。免疫组织化学法观察ICH后不同时间点血肿周围组织ROCKⅡ表达情况及对凝血酶表达的影响。蛋白质印迹(West-ern blotting)法检测ICH组血肿周围ROCKⅡ蛋白表达。并采用Longa和Forelimb Use Asymmetry神经功能缺损评分法对ICH48 h后S组、ICH组、ICH+A组进行神经功能评定。结果:ICH诱导血肿周围ROCKⅡ表达显著增加。造模后0.5 h,ICH组和ICH+A组血肿周围可见ROCKⅡ阳性细胞表达,24 h达高峰,以后逐渐下降,2组表达趋势类似,但在12 h后(包括12 h)相应时间点ICH+A组的ROCKⅡ表达水平显著低于ICH组(P<0.01)。S组病灶周围ROCKⅡ的表达水平均显著低于ICH组和ICH+A组,且细胞着色浅,并且无变化趋势。ICH组Western blotting蛋白条带所显示ROCKⅡ蛋白表达趋势和免疫组织化学结果一致。Longa和Forelimb Use Asymmetry神经功能缺损评分法均显示,ICH后48 h大鼠神经功能缺损评分ICH组和ICH+A组较S组显著增加(P<0.01),而ICH+A组显著低于ICH组(P<0.01)。结论:ROCKⅡ参与ICH后脑损伤,凝血酶可能通过促进ROCKⅡ的表达而产生ICH后脑损伤作用。

亚低温对脑出血后血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ表达影响的研究

目的通过观察亚低温对实验性脑出血后的血脑屏障(BBB)、BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的影响,进一步探讨亚低温减轻血管源性脑水肿的机制。方法将健康雄性SD大鼠(54只)随机分为3组:生理盐水组、脑出血组和亚低温+脑出血组。采用自体血注入法建立脑出血模型,伊文思蓝浓度测定BBB通透性、脑水含量(干湿重法),观察各组大鼠BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达(免疫组化法)。结果脑出血24 h后BBB通透性开始增加,72 h达高峰,7 d后开始下降,其变化趋势与脑水含量及BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达一致。亚低温+脑出血组的BBB通透性、脑水含量及BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达均低于脑出血组。结论脑出血后血管源性脑水肿的形成与BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ的高表达有关;亚低温可以通过减少其表达来减轻BBB通透性的增加,减轻脑水肿,进一步保护脑组织。

脑出血后血红蛋白对血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ及紧密连接蛋白claudin-5的影响

目的探讨脑出血后血红蛋白对血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ及紧密连接蛋白claudin-5的影响。方法将SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组（18只）和血红蛋白组（72只），血红蛋白组再按不同取材时间点分为24h、48h、3d、7d4个亚组（每个时间点18只）。血红蛋白组采用脑内注入血红蛋白法制作脑出血大鼠模型。免疫组化染色观察各组大鼠血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ及磷酸化肌球蛋白轻链的蛋白表达，伊文思蓝浓度测定评估血脑屏障通透性，免疫荧光染色和实时荧光定量PCR检测claudin-5蛋白和mRNA表达。结果免疫组化染色结果显示：正常对照组血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ及磷酸化肌球蛋白轻链表达较少，血红蛋白组血肿侧血脑屏障内皮细胞呈棕黄色及线条状表达；血红蛋白组48h、3d时血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ及磷酸化肌球蛋白轻链平均吸光度值明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。血红蛋白组各时间点脑内伊文思蓝含量均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。免疫荧光染色结果显示：与正常对照组相比，血红蛋白组24h、48h及3d时claudin-5蛋白表达断续和减少。实时荧光定量PCR结果显示：血红蛋白组24h、48h、3d及7d时claudin．5mRNA表达水平明显低于正常对照组，差异有统计学意义（氏0．05）。结论脑出血后血红蛋白可以导致血脑屏障内皮细胞Rho激酶Ⅱ的表达增高，进而致磷酸化肌球蛋白轻链表达增加、紧密连接蛋白claudin-5表达降低，其可能是导致脑出血后血脑屏障破坏及脑水肿发生的重要机制之一。

温针灸对大鼠脊髓损伤节段神经再生抑制因子RhoA、RockⅡ表达的影响

目的:观察温针灸对大鼠脊髓损伤(SCI)节段神经再生抑制因子Ras同源物基因A(RhoA)、Rho蛋白激酶Ⅱ(RockⅡ)表达的影响,探讨温针灸治疗脊髓损伤的作用机制。方法:将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、温针灸组和法舒地尔组,每组10只。假手术组仅去掉椎板,其余三组均以半切法建立SCI模型。假手术组、模型组术后不进行干预,温针灸组造模成功后予温针灸干预,法舒地尔组腹腔注射盐酸法舒地尔抑制剂。HE染色和尼氏染色观察组织形态学变化,免疫组化观察RhoA、RockⅡ蛋白表达,RT-qPCR检测RhoA、RockⅡmRNA表达。结果:假手术组脊髓神经细胞分布均匀、灰质白质分界清楚,尼氏细胞结构完整、数量分布集中、尼氏小体形态正常、着色均匀。模型组组织结构极度紊乱,细胞水肿、炎性浸润明显,尼氏细胞结构模糊、尼氏小体为异常的小颗粒状,着色不均。温针灸组和法舒地尔组均可逆转上述现象,改善组织水肿、增加神经元数量,促进尼氏细胞和尼氏小体组织形态的恢复。干预7、14 d,模型组RhoA、RockⅡ表达均高于假手术组同时间节点(P<0.05);干预7、14 d,温针灸组、法舒地尔组RhoA、RockⅡ表达低于模型组同时间节点,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:温针灸可促进SCI组织形态恢复、提高损伤神经再生能力,其作用机制可能与下调脊髓受损节段神经再生抑制因子RhoA、RockⅡ的表达有关。

丹参素对IUGR胎鼠脑神经细胞及脑组织Rho/ROCK信号通路的影响

目的:探讨丹参素对IUGR胎鼠脑神经细胞及脑组织Rho/ROCK信号通路的影响。方法:将40只孕鼠以随机数字表法分为正常组、IUGR组、IUGR+低剂量、中剂量、高剂量丹参素组,予以低蛋白饮食法建立IUGR模型,正常组、IUGR组于妊娠第12天尾静脉注射等体积生理盐水5.0 mg/(kg·d),丹参素低、中、高剂量组分别于妊娠第12天起尾静脉注射等体积不同浓度丹参素溶液,低剂量组10μg/(kg·d),中剂量组20μg/(kg·d),高剂量组30μg/(kg·d),于自然分娩后6 h内测定胎鼠体质量,麻醉处死后行脑组织HE染色,选择RT-PCR、Western blot法对RhoA、ROCKⅡmRNA及蛋白表达进行测定,流式细胞术检测脑神经细胞凋亡率。结果:IUGR组胎鼠体质量明显低于正常组,IUGR+丹参素高剂量组胎鼠体质量高于中剂量组、低剂量组(P<0.05)。IUGR组RhoA、ROCKⅡmRNA、蛋白表达及脑神经细胞凋亡率均高于正常组,而IUGR+丹参素高剂量组低于中剂量组、低剂量组(P<0.05)。结论:丹参素可调控Rho/ROCK信号通路并抑制其活性,以促进IUGR胎鼠脑神经细胞增殖,改善其生长发育。

夹脊电针对急性脊髓损伤大鼠脊髓组织微环境Rho-ROCK Ⅱ通路相关因子的影响

目的:观察夹脊电针对脊髓损伤大鼠神经细胞轴突再生相关抑制因子重组人Ras同源物基因家族成员A(RhoA)、Rho蛋白激酶Ⅱ(ROCKⅡ)、肌球蛋白轻链(MLC)蛋白的影响,探讨夹脊电针治疗急性脊髓损伤(ASCI)的作用机制。方法:雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、夹脊电针组、抑制剂组,每组12只。采用脊髓打击法制备大鼠ASCI模型。夹脊电针组于模型制备成功后3h进行夹脊电针治疗,每日1次,每次30 min,连续治疗14d、28d;抑制剂组于造模成功后立即给予腹腔注射盐酸法舒地尔(10mg/kg),每日1次,连续治疗14d、28d。采用BBB评分法评估大鼠后肢运动功能变化,免疫组化法检测各组大鼠脊髓组织中RhoA、ROCKⅡ、MLC蛋白的表达情况。结果:BBB评分结果显示:与假手术组比较,造模后14d、28d模型组大鼠运动功能评分显著降低(P<0.05);与模型组比较,造模后14d、28d夹脊电针组、抑制剂组大鼠运动功能评分均显著升高(P<0.05);夹脊电针组、抑制剂组造模后28d大鼠肢体运动功能评分较造模后14d显著升高(P<0.05)。免疫组化结果显示:与假手术组比较,造模后14d、28d模型组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数增加(P<0.05);与模型组相比,造模后14d、28d夹脊电针组、抑制剂组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数显著降低(P<0.05);夹脊电针组、抑制剂组造模后28d大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数较造模后14d显著降低(P<0.05)。结论:夹脊电针能够显著改善ASCI大鼠肢体运动功能,其作用机制可能与抑制大鼠脊髓损伤组织微环境Rho-ROCKⅡ信号通路RhoA、ROCKⅡ、MLC抑制因子表达有关。

Y27632对脊髓损伤微环境下新生大鼠背根节神经元轴突再生的影响

目的:探讨Rho蛋白激酶Ⅱ(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinaseⅡ,ROCKⅡ)特异性抑制剂Y-27632对脊髓损伤微环境下新生大鼠背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元轴突再生和延长的影响。方法:取新生(<5d)SD大鼠胸腰段DRG神经元进行原代培养、提纯和鉴定。将健康雌性SD成年大鼠15只随机分为脊髓损伤组、假手术组和正常组,每组5只;用WD法制成T9平面脊髓损伤动物模型,造模7d后取T8～T10节段脊髓制作脊髓提取液。将新生大鼠DRG神经元分为5组进行培养:A组,DRG神经元+PBS;B组,DRG神经元+正常组脊髓提取液;C组,DRG神经元+假手术组脊髓提取液;D组,DRG神经元+损伤脊髓提取液;E组,DRG神经元+损伤脊髓提取液+不同浓度(5、10、20、30、40、50μmol/L)Y27632。培养2d后观察并比较各组新生大鼠DRG神经元轴突平均长度和微管(TubulinβⅢ)荧光表达强度。结果:A、B和C组平均神经轴突长度及轴突远端tubulinβⅢ表达强度比较无统计学差异(P>0.05);D组明显减小,与A、B和C组分别比较有统计学差异(P<0.05)。5、10μmol/LY27632治疗组平均轴突长度以及轴突远端和生长锥tubulinβⅢ表达强度比D组有所增加(P<0.05),10μmol/LY27632治疗组增加更明显,但小于A、B和C组(P<0.05)。20～50μmol/LY27632治疗组平均轴突长度以及轴突远端和生长锥tubulinβⅢ表达强度三组间比较无统计学差异(P>0.05);与5～10μmol/LY27632治疗组、D组比较明显增加(P<0.05);与A、B、C组比较平均轴突长度无统计学差异(P>0.05),平均荧光密度明显增加(P<0.05)。结论:损伤脊髓提取液能明显抑制新生大鼠DRG神经元轴突生长,导致轴突回缩。加入5～10μmol/LY27632能促进轴突生长,20～50μmol/LY27632更能明显促进轴突生长。

牛磺酸抑制Rho／ROCK信号通路活性促进生长受限胎鼠神经干细胞增殖的研究

目的研究牛磺酸对宫内生长受限（intrauterine growth restriction，IUGR）胎鼠神经干细胞（NSCs）增殖及Ras同源基因A（RhoA）、Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶（ROCK）Ⅱ表达的影响。 方法采用低蛋白饮食法建立IUGR胎鼠模型。取胎鼠室管膜下生发基质区（SVZ）脑组织进行NSCs培养。将所得NSCs分为5组：正常对照组（Ⅰ组）、IUGR组（Ⅱ组）、IUGR＋牛磺酸组（Ⅲ组）、IUGR＋ROCK阻断剂组（Ⅳ组）、IUGR＋牛磺酸＋ROCK阻断剂组（Ⅴ组）。采用免疫荧光法检测各组脂肪酸结合蛋白7（FABP7）阳性细胞数；实时荧光定量PCR法检测各组细胞RhoA、ROCKⅡ mRNA水平；采用Western blot法检测各组细胞RhoA、ROCKⅡ蛋白水平。 结果1.以Ⅰ组为标准计数，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组FABP7阳性细胞计数比例分别为（100.0±1.6）%、（63.8±5.2）%、（82.8±4.3）%、（78.6±2.7）%、（87.6±3.2）%，Ⅱ组较Ⅰ组减少约36%，差异有统计学意义（t＝14.98，P〈0.01）；Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅴ组FABP7阳性细胞数呈逐渐增加趋势，组间比较差异有统计学意义（F＝66.53，P〈0.01）。2.Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组RhoA mRNA表达水平分别为1、3.05±0.36、2.15±0.19、1.89±0.11、1.66±0.11，ROCKⅡmRNA表达水平分别为1、2.78±0.27、2.12±0.21、1.74±0.12、1.53±0.12，Ⅱ组RhoA及ROCKⅡ mRNA水平均较Ⅰ组显著增加（t＝－12.61、－14.67，均P〈0.01），Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组中RhoA及ROCKⅡ mRNA的表达呈逐渐下降趋势，组间比较差异均有统计学意义（F＝73.20、76.38，均P〈0.01）。3.Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组RhoA蛋白相对表达分别为0.37±0.03、0.87±0.02、0.73±0.04、0.72±0.04、0.55±0.04，ROCKⅡ蛋白相对表达分别为0.46±0.03、0.96±0.02、0.74±0.01、0.63±0.02、0.55±0.03，Ⅱ组RhoA及ROCKⅡ蛋白水平较Ⅰ组均显著增加（t＝－27.60、－35.77，均P〈0.01）；Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组中ROCKⅡ蛋白的表达呈逐渐下降趋势，组间比较差异有统计学意义（F＝390.16，P〈0.01）；RhoA蛋白在Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅴ组中的表达呈逐渐下降趋势，组间比较差异有统计学意义（F＝130.51，P〈0.01），Ⅲ组及Ⅳ组间比较，差异无统计学意义（t＝0.46，P〉0.05）。 结论牛磺酸可能通过抑制Rho/ROCK信号通路促进IUGR胎鼠NSCs增殖，从而改善其脑发育。