Rho激酶通路的激活对血管收紧缩张的素作Ⅱ用诱导的人气道平滑肌细胞

目的探讨Rho激酶通路的激活对血管紧张素I(IAng II)诱导的人气道平滑肌细胞(human airway smooth musclecells,HASMCs)收缩的作用及其机制。方法原代培养人气道平滑肌细胞,分为对照组、AngII组、AngII+伊贝沙坦[AngII1型受体(AT1R)阻断剂,IRB]组、AngII+Y-27632(Rho激酶抑制剂)组分别用胶原收缩法、免疫荧光等从细胞形态检测AngII对细胞收缩的影响及Western Blot在蛋白水平上检测Rho激酶通路蛋白的变化。结果 Y-27632、伊贝沙坦均可显著抑制AngI(I10-7 mol/L)诱导的人气道平滑肌细胞收缩,两组的抑制作用无显著差异(P>0.05);Y-27632对AngII诱导的Rho激酶底物磷酸化moesin的表达的抑制作用显著高于伊贝沙坦(P<0.05)。结论 AngII诱导的HASMCs收缩可能与Rho激酶通路的激活有关。

RhoA/Rho激酶通路在血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管外膜成纤维细胞表达纤维连接蛋白中的作用

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠血管外膜成纤维细胞(VAF)纤维连接蛋白(FN)表达的影响,并探讨RhoA/Rho激酶通路在AngⅡ诱导FN表达中的相关机制。方法分别以不同时间(0、6、12、24、48h)和不同剂量(0、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)AngⅡ刺激体外培养的SD大鼠VAF,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应及Western blot检测FN的表达变化,并分别应用表达目的基因N19RhoA的重组腺病毒和Rho激酶抑制剂Y27632进行干预,观察其对AngⅡ诱导FN表达的影响。结果 AngⅡ促进大鼠VAF表达FN。应用10-7 mol/L AngⅡ刺激VAF 24h,FN mRNA表达和蛋白表达增高最为明显(均P<0.05)。与AngⅡ刺激组比较,表达目的基因N19RhoA的重组腺病毒和Y27632可明显抑制AngⅡ诱导的FN mRNA(N19RhoA组0.78±0.11,Y27632组0.72±0.08比AngⅡ刺激组1.82±0.12,均P<0.05)和蛋白表达(N19RhoA组1.56±0.12,Y27632组1.43±0.12比AngⅡ刺激组3.89±0.32,均P<0.05)。结论 AngⅡ促进大鼠VAF表达FN,RhoA/Rho激酶通路参与了该过程的调控。

补阳还五汤通过调节HUVEC细胞Rho/Rho激酶信号通路作用于动脉粥样硬化的研究

目的研究补阳还五汤抗同型半胱氨酸(Hcy)诱导的脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的作用及其机制。方法采用Hcy造模,将内皮细胞随机分为10组,即空白组(10%空白血清),模型组(Hcy+10%空白血清),补阳还五汤低剂量组(5%含药血清+Hcy)、中剂量组(10%含药血清+Hcy)、高剂量组(20%含药血清+Hcy),10%FBS+Hcy对照组,Rho激酶(ROCK)阻断剂Y27632+Hcy组,靶分子肌球蛋白轻链激酶(MLCK)阻断剂ML-7+Hcy组,丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB203580+Hcy组,细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059+Hcy组,24 h后,用IP裂解液(含PMSF)裂解细胞。用蛋白质印迹法(Western blot)测定ROCK、MLCK蛋白水平,用RT-PCR技术测定ROCK、MLCK m RNA的表达情况,并用激光共聚焦测定细胞骨架结构蛋白纤维肌动蛋白(F-actin)的变化。结果 Western blot与RT-PCR结果显示:模型组与空白组比较,HUVEC细胞ROCK、MLCK蛋白以及其m RNA水平明显上升,而补阳还五汤含药血清组和抑制剂组对其有明显的下调作用。激光共聚焦检测骨架蛋白F-actin实验中,与空白组比较,模型组细胞应力纤维明显增多;而补阳还五汤各剂量组相对于模型组,应力纤维的形成明显降低。结论补阳还五汤可能通过调节内皮细胞Rho/Rho激酶信号通路,阻止细胞骨架的改变,减轻内皮细胞损伤而发挥其抗动脉粥样硬化的作用。

炎调方调节RhoA/ROCK信号通路对急性胰腺炎大鼠肠屏障损伤的影响

目的观察炎调方调节Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶(ROCK)信号通路对急性胰腺炎(AP)大鼠肠屏障损伤的影响。方法将84只大鼠随机分为对照组、模型组、炎调方低剂量组、炎调方高剂量组、乌司他丁组、溶血磷脂酸(LPA)组、炎调方+LPA组,每组12只。除对照组外,其他组构建AP大鼠模型。造模成功后立即进行给药处理,每6小时给药1次,共4次。ELISA法检测大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)水平;HE染色检测大鼠胰腺组织和回肠组织病理变化;免疫组化染色检测大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白平均光密度;Western blotting检测回肠组织中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤严重,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度降低(P<0.05);与模型组比较,炎调方低剂量组、炎调方高剂量组、乌司他丁组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤减轻,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达降低,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度升高,LPA组对应指标变化趋势与上述相反(P<0.05);与炎调方高剂量组比较,炎调方+LPA组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤加剧,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度降低(P<0.05)。结论炎调方可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善AP大鼠炎症反应及肠屏障损伤。

Rho激酶信号通路与大鼠心肌细胞凋亡的关系

目的探讨Rho激酶信号通路在心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡组织中的表达变化及对心肌细胞凋亡的影响作用。方法选取健康雄性Wistar大鼠,通过结扎左前降支建立大鼠心肌梗死模型,将24 h后仍然存活的大鼠选取30只,随机分为模型组和治疗组(法舒地尔5 mg/kg,2次/d)各15只,并另外选取健康雄性大鼠15只作为假手术组,假手术组和模型组给予等量生理盐水处理,比较4 w后3组心肌梗死面积及Rho激酶mRNA、蛋白等指标的表达差异。结果 3组左心室收缩压(LVSP)、左室舒张压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)差异均有统计学意义(P<0.05),模型组LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著低于治疗组和假手术组(P<0.05),LVEDP显著高于治疗组和假手术组(P<0.05),治疗组LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著低于假手术组(P<0.05),LVEDP显著高于假手术组(P<0.05)。治疗组心肌缺血面积低于模型组但差异不显著(P>0.05);治疗组心梗面积显著低于模型组(P<0.05)。3组Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05);组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论心肌梗死大鼠心肌组织中的Rho激酶mRNA、Bax蛋白达显著增加,同时Bcl-2蛋白表达降低,法舒地尔能够降低Rho激酶mRNA表达,减少心肌细胞凋亡,减轻心肌梗死面积。

Rho/Rho激酶信号通路与脉管收缩

Rho/Rho激酶信号通路在正常血管、淋巴管等脉管收缩过程中发挥重要的调节作用,并参与休克后血管反应性和钙敏感性的双相调节以及休克淋巴管低反应性的发生。以Rho/Rho激酶为靶点,对于干预休克脉管系统低反应性的发生具有重要意义。本文综述Rho/Rho激酶信号通路在脉管收缩中的调节机制。

同型半胱氨酸通过Rho激酶信号通路促进大鼠脑基底动脉平滑肌细胞活力与迁移

目的:探讨同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对大鼠脑基底动脉平滑肌细胞(basilar arterial smooth muscle cells,BASMCs)活力和迁移的作用及可能的分子机制。方法:分离培养大鼠BASMCs,给予不同浓度的Hcy刺激后,用CCK-8法初步测定细胞活力的变化,Western blot检测Rho激酶信号通路的活性。然后固定Hcy的浓度(1 mmol/L),并采用ROCK抑制剂Y-27632作为工具药对细胞进行处理,流式细胞术检测细胞的周期分布,划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移情况;检测细胞抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平反映细胞的氧化应激状态。结果:Hcy可浓度依赖性地提高BASMCs的活力,并上调细胞中GTP-RhoA和ROCK2的蛋白表达(P<0.05);同浓度的Hcy处理细胞后,48 h处理组的细胞活力显著高于24 h处理组(P<0.05)。Hcy处理组BASMCs中S期细胞的比例明显升高,G0/G1期细胞的比例显著降低(P<0.05);加入Y-27632预处理可显著抑制Hcy处理组BASMCs的G1/S期转换。划痕实验和Transwell的实验结果显示,Hcy处理组BASMCs的迁移率显著高于对照组;加入Y-27632预处理可抑制Hcy处理组BASMCs的迁移(P<0.05)。此外,Hcy可降低BASMCs中SOD和GSH-Px的活性,同时升高MDA的含量;相较Hcy处理组,加入Y-27632预处理后,细胞内SOD和GSH-Px的活性升高,MDA的含量降低(P<0.05)。结论:同型半胱氨酸可促进大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的活力及迁移,其作用机制可能与激活Rho激酶信号通路并提高细胞内氧化应激的水平有关。

番茄红素调节RAS同源基因家族成员A/Rho相关激酶信号通路对氧化低密度脂蛋白诱导脑血管内皮细胞凋亡的影响

目的探讨番茄红素(LYC)调节RAS同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关激酶(ROCK)信号通路对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的脑血管内皮细胞(EC)凋亡的影响。方法未做任何处理的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)设为NC组;采用ox-LDL处理的HBMECs分为ox-LDL组、LYC组(0.5μmol/L的LYC处理HBMECs)、溶血磷脂酸(LPA)组(5μmol/L RhoA/ROCK信号通路激活剂LPA处理HBMECs)、LYC+LPA组(0.5μmol/L的LYC以及5μmol/L LPA共同处理HBMECs);处理24 h后用于后续实验。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBMECs细胞因子水平;CCK-8法检测HBMECs增殖;流式细胞术检测HBMECs凋亡率;Western blot检测细胞血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)、平滑肌(SM)22α、BCL-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)、RhoA/ROCK通路相关蛋白表达。结果与NC组相比,ox-LDL组单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素(IL)-6、血管内皮细胞黏附分子1(VCAM-1)、HBMECs凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α、RhoA、ROCK1蛋白水平升高,OD值、Bcl-2、CD31蛋白水平下降,差异有统计学意义(P<0.05);与ox-LDL组相比,LYC组MCP-1、IL-6、VCAM-1、HBMECs凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α、RhoA、ROCK1蛋白水平降低,OD值、Bcl-2、CD31蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而LPA组趋势相反;LPA减弱了LYC对ox-LDL诱导的HBMECs凋亡的改善作用。结论LYC可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路来减轻HBMECs凋亡。

黄芩苷通过ROS依赖性调节RhoA/ROCK通路保护氯化钴诱导心肌细胞损伤的实验研究

目的:本研究旨在探讨黄芩苷(Baicalin)对氯化钴(CoCl_(2))诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的作用机制。方法:采用CoCl_(2)建立心肌细胞缺氧损伤模型,并分别加入不同浓度的黄芩苷培养。将正常氧培养设置为对照组,CoCl_(2)培养H9c2心肌细胞设置为CoCl_(2)组;Baicalin、Y27632(Rho激酶抑制剂)预处理的H9c2缺氧心肌细胞设置为CoCl_(2)+Baicalin组、CoCl_(2)+Y27632组、CoCl_(2)+Baicalin+Y27632组。通过细胞毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞活性;荧光探针测定细胞中活性氧(ROS)的表达;WST-8检测心肌细胞超氧化歧化酶(SOD)活力;TBA法测定丙二醇(MDA)浓度;同时采用WesternBlot方法分析RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达情况。结果:处理H9c2细胞24 h后,1 000μmol/L的CoCl_(2)和75μmol/L黄芩苷对治疗心肌细胞缺氧损伤具有较好的细胞活力。CoCl_(2)组细胞活性明显低于对照组,加入黄芩苷后可显著提高细胞活性(P<0.05);与对照组相比,CoCl_(2)组心肌细胞可上调ROS、MDA表达,下调SOD活力,升高RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,加入Baicalin后可逆转上诉蛋白的表达水平;与CoCl_(2)组相比,CoCl_(2)+Baicalin可抑制ROS、MDA的表达,上调SOD含量,下调RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,而加入Y27632(Rho激酶抑制剂)后则可显著增强Baicalin带来的保护作用。结论:Baicalin可减轻CoCl_(2)诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的炎症、氧化应激反应,其机制与抑制ROS依赖性RhoA/ROCK通路有关。

Rho激酶抑制剂在眼部疾病中的作用研究进展

Rho激酶(ROCK)是Rho家族的关键效应器蛋白,通过Rho/ROCK信号通路在多种细胞生物学过程中发挥关键作用,包括细胞形态改变、细胞骨架重组、细胞运动以及细胞-细胞和细胞-基质相互作用等。Rho/ROCK信号通路的异常激活可介导多种疾病的发生、发展,并与这些疾病的病理过程相关。ROCK抑制剂通过抑制Rho/ROCK信号通路发挥神经保护、抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等作用,因此其在多种疾病中具有潜在治疗价值。ROCK抑制剂在眼部疾病(青光眼、角膜疾病和视网膜疾病等)治疗中展现出巨大潜力,或可为这些疾病的治疗提供一种全新的策略和方法。

Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶通路阻断剂Y-27632对大鼠脂肪组织源性干细胞向神经元样细胞分化的诱导作用

目的：研究Y-27632对大鼠脂肪间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化作用.方法：原代培养大鼠脂肪间充质干细胞,将3～6代细胞随机分成4组,无血清对照组、无血清诱导组、血清对照组、血清诱导组.采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学检测巢蛋白、神经元特异性核心抗原（NeuN）、血清应答因子（SRF）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、vimentin的表达,免疫印迹检测SRF、vimentin的表达.结果：在无血清情况下,Y-27632能够诱导脂肪组织源性干细胞（ADSCs）出现典型的神经元样细胞形态,免疫细胞化学检测显示神经元特异性蛋白巢蛋白、NeuN的阳性表达；而在10％血清条件下,这种诱导效应被抑制,巢蛋白、NeuN无阳性表达.免疫细胞化学染色显示无血清条件下,Y-27632能够显著抑制α-SMA的表达,同时SRF和vimentin也具有较强的阳性表达.免疫印迹检测显示无论是否存在血清,Y-27632均能够抑制SRF的表达；vimentin在无血清＋Y-27632组表达高于其他各组.结论：Y-27632能够诱导ADSCs向神经元样细胞分化并伴随神经特异标记物的表达.

羟丁酸钠通过Rho/Rho激酶信号通路减轻脑缺血再灌注大鼠脑损伤

目的:探讨羟丁酸钠通过Rho/Rho激酶信号通路对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的作用。方法:通过右侧血管内大脑中动脉闭塞(MCAO)构建局灶性脑缺血再灌注模型。造模前40 min腹腔给予50、100、200 mg/kg羟丁酸钠,1次/d,连续灌胃1周。尼莫地平组腹腔每天给予0.7 mg/kg尼莫地平,水仙环素组和给药高剂量+水仙环素组以相同方式每天给予10 mg/kg水仙环素。对照组和模型组大鼠注射等体积生理盐水。开场行为检测自发活动情况,T迷宫实验检测学习记忆能力,检测脑组织含水量,HE染色观察脑损伤,TUNEL染色检测脑细胞凋亡情况,qRT-PCR检查RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβmRNA表达水平,Western blot检测cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβ蛋白表达水平。结果:与模型组相比,给药高剂量组大鼠10 min内爬行经过的格子数目明显减少(P<0.01),选择正确次数明显增多(P<0.01),脑组织含水量明显减少(P<0.01),脑组织细胞凋亡率明显减少(P<0.01),脑组织cleaved caspase-3和Bax表达明显下调、Bcl-2表达明显上调(P<0.01),脑组织RhoA、Rho-kinaseα和Rho-kinaseβmRNA表达水平明显下调(P<0.01),给予Rho/Rho激酶信号通路激活剂水仙环素后,可逆转上述改变。结论:羟丁酸钠通过抑制Rho/Rho激酶信号通路减轻脑缺血再灌注大鼠脑损伤。

麦冬皂苷B调节Rho A/ROCK1信号通路对胃荷瘤大鼠肿瘤生长的抑制作用

目的 探讨麦冬皂苷B(ophiopogonin B,OP-B)对胃荷瘤大鼠肿瘤生长的影响及其作用机制。方法 将66只体质量为180~200 g的6周龄SPF级SD大鼠(雌雄各半)按随机数字表法分为模型组,OP-B低、中、高剂量组,激活剂组,每组10只。采用原位移植Walker-256肿瘤组织建立胃荷瘤模型,OP-B低、中、高剂量组大鼠分别灌胃17.5、35、70 mg/kg的OP-B并腹腔注射等量生理盐水,激活剂组灌胃70 mg/kg的OP-B并腹腔注射1 mg/kg的Rho A/ROCK1信号通路激活剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA),模型组灌胃和腹腔注射等量的生理盐水;记录移植瘤质量及体积,计算抑瘤率;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肿瘤组织形态;原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)染色检测肿瘤组织细胞凋亡;免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞核增殖抗原67(proliferating cell nuclear antigen, Ki-67)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Cleaved Caspase-3)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测Ras同源基因家族蛋白A(Ras homologous gene family member A,Rho A)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase1,ROCK1)的表达;Western blot检测Rho A、ROCK1蛋白表达。结果 与模型组比较,OP-B低、中、高剂量组肿瘤质量和体积、Ki-67阳性率及Rho A、ROCK1 mRNA和蛋白表达显著降低,抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3阳性率显著升高(P<0.05);与OP-B高剂量组比较,激活剂组肿瘤质量和体积、Ki-67阳性率及Rho A、ROCK1 mRNA和蛋白表达显著升高,抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3阳性率显著降低(P<0.05)。结论 OP-B可能通过抑制Rho A/ROCK1信号通路的激活,抑制胃荷瘤大鼠肿瘤生长。

水蛭素调节RhoA/ROCK信号通路对脑梗死大鼠神经元细胞凋亡和炎症反应的影响

目的:探讨水蛭素(HRD)调节Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路对脑梗死大鼠神经元细胞凋亡和炎症反应的影响。方法:将SD大鼠分为Ct组、Model组、低剂量HRD组(HRD-L组,13.33 mg/kg)、高剂量HRD组(HRD-H组,26.66 mg/kg)、阳性对照尼莫地平组(NMDP组,40 mg/kg)、U-46619(RhoA激动剂,0.03 mg/kg)组、HRD-H+U-46619组(26.66 mg/kg+0.03 mg/kg),每组24只。除Ct组外,其他组大鼠均利用改良线栓法构建脑梗死模型,Ct组大鼠仅暴露血管,不进行切口和插线栓。建模成功1 h后,进行给药处理。给药1次/d,持续4周。Zea-Longa法评估大鼠神经功能;干湿重法检测大鼠脑组织含水量;2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)染色测定大鼠脑梗死体积;TUNEL染色检测大鼠海马CA1区神经元凋亡;ELISA检测大鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平;Western blot检测大鼠海马组织中裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达。结果:与Ct组比较,Model组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑梗死体积百分比、神经元凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平、Cleaved-Caspase-3、Bax、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高(P<0.05);与Model组比较,HRD-L组、HRD-H组、NMDP组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑梗死体积百分比、神经元凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平、Cleaved-Caspase-3、Bax、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达降低,而U-46619组对应指标变化呈相反趋势(P<0.05);与HRD-H组比较,HRD-H+U-46619组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑梗死体积百分比、神经元凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平、Cleaved-Caspase-3、Bax、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高(P<0.05)。结论:HRD可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路抑制脑梗死大鼠神经元凋亡及炎症反应。

飞燕草素调控RhoA/ROCK信号通路对结肠癌细胞生物学行为及血管生成拟态形成的影响

目的:探讨飞燕草素调控Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路对结肠癌细胞生物学行为及血管生成拟态形成的影响。方法:将人结肠癌细胞SW620随机分为对照组、飞燕草素低浓度组(含45μmol/L飞燕草素培养基培养)、飞燕草素中浓度组(含90μmol/L飞燕草素培养基培养)、飞燕草素高浓度组(含180μmol/L飞燕草素培养基培养)、飞燕草素高浓度+RhoA过表达组(转染RhoA过表达质粒+含180μmol/L飞燕草素培养基培养)。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法、Transwell及划痕实验分别检测SW620细胞增殖、侵袭及迁移能力。采用流式细胞术检测SW620细胞凋亡情况。血管生成实验检测SW620细胞血管生成拟态形成情况。采用RT-qPCR检测SW620细胞RhoA、ROCK mRNA表达。采用Western blot检测SW620细胞RhoA、ROCK、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达。结果:与对照组比较,飞燕草素低、中、高浓度组SW620细胞存活率、侵袭细胞数、迁移率、血管生成拟态管状结构数、RhoA和ROCK mRNA及蛋白表达水平、VEGF蛋白表达水平呈浓度依赖性降低,凋亡率呈浓度依赖性升高(均P<0.05)。与飞燕草素高浓度组比较,飞燕草素高浓度+RhoA过表达组SW620细胞存活率、侵袭细胞数、迁移率、血管生成拟态管状结构数、RhoA和ROCK mRNA及蛋白表达水平、VEGF蛋白表达水平升高,凋亡率降低(均P<0.05)。结论:飞燕草素可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路减弱结肠癌细胞恶性生物学行为及血管生成拟态形成,并促进细胞凋亡。

藁本内酯通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善脂多糖诱导小鼠肾足细胞损伤

【目的】探讨藁本内酯对脂多糖(LPS)诱导小鼠肾足细胞损伤的改善作用及机制。【方法】(1)体内实验:将小鼠随机分为空白对照组,LPS诱导组,藁本内酯低、高剂量组及藁本内酯高剂量+pcDNA-NC(RhoA阴性对照)组、藁本内酯高剂量+pcDNA-RhoA(RhoA过表达)组。除空白对照组,其他各组小鼠采用LPS诱导法构建急性肾损伤(AKI)模型。干预结束后,检测小鼠血清中尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平,高碘酸-希夫(PAS)染色法观察小鼠肾脏组织的病理变化,Western Blot法检测肾脏组织中RhoA、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)蛋白的表达。(2)体外实验:将培养的小鼠足细胞MPC5分为空白对照组,LPS诱导组,藁本内酯低、高剂量组,藁本内酯高剂量+pcDNA-NC组,藁本内酯高剂量+pcDNA-RhoA组,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测足细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,鬼笔环肽染色法分析细胞骨架,Western Blot法检测细胞RhoA、ROCK蛋白的表达。【结果】与空白对照组比较,LPS诱导组小鼠血清中BUN和Cr的水平、肾小管损伤评分、RhoA和ROCK蛋白表达水平升高(P<0.05);与LPS诱导组比较,藁本内酯低、高剂量组小鼠血清中BUN和Cr水平、肾小管损伤评分、RhoA和ROCK表达水平降低(P<0.05)。与空白对照组比较,LPS诱导组MPC5细胞增殖活性、F-肌动蛋白荧光强度、RhoA和ROCK的表达降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05);与LPS诱导组比较,藁本内酯低、高剂量组MPC5细胞增殖活性、F-肌动蛋白荧光强度、RhoA和ROCK的表达升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05)。利用过表达RhoA进行回补实验发现,RhoA过表达逆转了藁本内酯对LPS诱导小鼠肾组织和足细胞损伤的缓解作用(P<0.01)。【结论】藁本内酯可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善LPS诱导小鼠肾足细胞损伤。

法舒地尔对大鼠动脉粥样硬化及Rho激酶表达的影响

目的探讨Rho激酶抑制剂-法舒地尔对大鼠动脉粥样硬化的防治作用及其相关机制。方法以普通饮食喂养大鼠作为对照组(n=10);链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠内膜损伤存活后,高脂饮食8周,分为动脉硬化组、瑞舒伐他汀组及法舒地尔组(n=10),继续高脂饮食4周,药物干预2个月,行血脂、血管细胞黏附分子-(lVCAM-1)、细胞间黏附分子-(lICAM-1)及Rho激酶mRNA检测。结果与对照组相比,动脉硬化组大鼠血脂增高,VCAM-1、ICAM-1及Rho激酶mRNA表达增加(P<0.05);与动脉硬化组对比,瑞舒伐他汀组各指标均改善,而法舒地尔组除对血脂无明显影响外,与瑞舒伐他汀具有相似的抗动脉粥样硬化作用(P<0.05)。结论法舒地尔具有抗动脉粥样硬化作用,其机制可能在于通过干预Rho/Rho激酶信号通路表达,抑制动脉内皮的炎症反应。

Rho/Rho激酶在COPD大鼠气道的表达及其对气道重塑的影响

目的探讨Rho/Rho激酶信号通路在慢性阻塞性肺疾病大鼠气道中的表达及其对气道的影响。方法清洁级相同重量级Wistar大鼠60只,随机分为正常对照组、COPD组、Y-27632干预组,每组20只。分析各组大鼠的支气管壁厚度(Wat)和平滑肌厚度(Wam),以及RhoA,ROCKⅡmRNA的表达。结果与对照组相比,COPD组大鼠RhoA,ROCKⅡmRNA表达明显增高,Wat、Wam也明显增加(P<0.05);与COPD组相比,Y-27632干预组大鼠RhoA,ROCKⅡmRNA的表达明显降低,Wat、Wam也明显降低(P<0.05)。结论 COPD组大鼠RhoA,ROCKⅡmRNA表达明显增高;应用ROCKⅡ特异性拮抗剂Y-27632能够明显控制RhoA,ROCKⅡmRNA的表达,从而抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠的气管壁增厚和平滑肌增殖。

泮托拉唑对肝硬化门静脉高压大鼠RhoA/ROCK通路及胃黏膜微循环的影响

目的:探讨泮托拉唑对肝硬化门静脉高压(PHT)大鼠Ras同源基因家族成员A/Rho相关激酶(RhoA/ROCK)通路及胃黏膜微循环的影响。方法:橄榄油和40%四氯化碳(CCl4)混合液注射,并同时猪油、胆固醇饲养建立肝硬化PTH大鼠模型,模型成功大鼠随机分为3组:模型组、泮托拉唑组(静脉滴注0.8 mg·kg^(-1)泮托拉唑)、泮托拉唑+U-46619组(静脉滴注0.8mg·kg^(-1)泮托拉唑+1.5 pg·kg^(-1)U-46619),同时设置对照组(静脉滴注等体积生理盐水),每日1次,连续5 d。右颈动脉插管检测门静脉压力(PVP)、平均动脉压(MAP)、心率(HR);全自动生化仪检测肝功能指标天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(Alb)、球蛋白(GLO)、总蛋白(TP)水平,并计算AST/ALT、白蛋白/球蛋白(A/G);苏木精-伊红(HE)检测肝组织、胃黏膜组织形态学变化;蛋白免疫印迹(WB)检测胃黏膜组织RhoA、ROCK、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素-1(ET-1)蛋白水平。结果:模型组肝细胞多数空泡增大、肝细胞脂变、坏死严重,胃黏膜微绒毛损伤严重,细胞间稀疏,核收缩、深染,炎症浸润;泮托拉唑组肝细胞空泡症状不明显,胃黏膜微绒毛损伤得以缓解;泮托拉唑+U-46619组肝细胞脂变、坏死,胃黏膜微绒毛损伤相较于泮托拉唑组严重,细胞间隔变大、细胞核收缩、深染严重。与对照组相比,模型组PVP、HR,静脉血中AST、ALT、GLO水平,胃黏膜组织中RhoA、ROCK、AngⅡ、ET-1蛋白水平升高,MAP、AST/ALT、Alb、A/G水平降低(P<0.05);与模型组相比,泮托拉唑组PVP、HR,静脉血中AST、ALT、GLO水平,胃黏膜组织中RhoA、ROCK、AngⅡ、ET-1蛋白水平降低,MAP、AST/ALT、Alb、A/G水平升高(P<0.05);与泮托拉唑组相比,泮托拉唑+U-46619组PVP、HR,静脉血中AST、ALT、GLO水平,胃黏膜组织中RhoA、ROCK、AngⅡ、ET-1蛋白水平升高,MAP、AST/ALT、Alb、A/G水平降低(P<0.05)。结论:泮托拉唑在肝硬化PHT中可以通过抑制RhoA/ROCK通路实现对胃黏膜损伤的缓解。

丁苯酞依赖Rho激酶/组织因子途径减弱内皮中性粒细胞的聚集来改善脑缺血/再灌注损伤

目的明确丁苯酞是否依赖Rho激酶/组织因子(TF)途径减弱内皮中性粒细胞的聚集来改善脑缺血/再灌注损伤。方法选择SPF级健康雄性ICR小鼠40只,鼠龄11~12周龄,体质量20~30 g。随机(随机数字法)分为空白组、模型组、单纯3-正丁基苯酞(NBP)治疗组,NBP+TF抑制组。建立缺血/再灌注损伤模型,单纯NBP治疗组、NBP+TF抑制组造模后予以NBP注射液[10 mg/(kg·d)]连续腹腔注射7 d。空白组、模型组均予以等量0.9%氯化钠溶液(生理盐水)腹腔注射7 d。造模后评估各组给药前后神经功能缺损评分[神经严重缺损评分(NSS)]、血压变化;苏木精-伊红(HE)染色光学显微镜下观察脑组织结构损伤程度,用Western blot检查Rho激酶的相对活性,聚合酶链式反应(PCR)技术检测TF mRNA的水平,酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测嗜中性粒细胞趋化因子(CINC)表达水平。结果与模型组比较,单纯NBP治疗组缺血再灌注小鼠脑组织的病理损伤明显改善,血压降低[复苏2 h:(127.18±3.24)mmHg vs(128.25±2.85)mmHg;给药7 d:(88.68±8.68)mmHg vs(113.68±3.44)mmHg],Rho激酶活性(0.34±0.10 vs 0.64±0.14)及TF mRNA表达降低(0.40±0.12 vs 0.96±0.18),内皮细胞损伤引起的炎症反应减弱[CINC含量:(14.84±2.39)pg/mL vs(43.68±3.25)pg/mL],显著改善神经功能缺损症状[NSS:造模苏醒时,(9.40±2.01)分vs(9.30±1.84)分;给药7 d,(6.00±2.08)分vs(8.00±1.82)分](P<0.05)。与模型组比较,NBP+TF抑制组大鼠中Rho激酶活性也能降低(0.57±0.15 vs 0.64±0.14),血压降低[给药7 d:(100.56±3.27)mmHg vs(88.68±8.68)mmHg],但对内皮-嗜中性粒细胞相互作用的抑制作用不明显[CINS含量:(35.25±2.51)pg/mL vs(43.68±3.25)pg/mL],脑组织结构不完全性损伤,神经功能缺损症状改善不明显[NSS:造模苏醒时,(9.50±1.96)分vs(9.30±1.84)分;给药7 d,(7.10±1.25)分vs(8.00±1.82)分](P>0.05)。结论NBP依赖Rho激酶/TF途径减弱内皮-嗜中性粒细胞相互作用,来改善脑缺血/再灌注损伤。