Rho鸟苷酸解离抑制因子-2过表达载体的构建与慢病毒包装

目的:为研究β2肾上腺素能受体减敏的机制,构建Rho鸟苷酸解离抑制因子-2(Rho GDI2)过表达慢病毒载体。方法:GenBank搜索Rho-GDI2基因序列(Gene ID:14570,序列号:NM_008113),设计PCR引物扩增目的基因,双酶切后凝胶电泳回收酶切产物。质粒双酶切获得线性载体,将目的基因和线性载体进行琼脂糖凝胶电泳分离回收目的条带。再行目的基因和载体的连接,连接产物转化感受态细胞;菌液PCR阳性克隆鉴定并抽提质粒并测序。最后293T细胞内包装慢病毒质粒并测其病毒活力与滴度。结果:通过DNAStar SeqMan软件对测序结果进行分析,测序结果与目标序列一致。病毒质粒转染细胞效率较高,病毒活力较高,通过标准曲线测得病毒滴度pLenti-GDI慢病毒液:1.22×108vp/mL。结论:成功构建了Rho GDI2过表达慢病毒载体。

鸟苷酸解离抑制因子-2真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rab蛋白鸟苷酸解离抑制因子-2(GDI2)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法聚合酶链反应(PCR)扩增GDI2基因片段,构建pcDNA3.1-GDI2真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性,脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株。免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达GDI2蛋白。结论 GDI2真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究GDI2过度表达对肿瘤侵袭和转移的影响奠定了实验基础。

RhoGDIs在调节RhoGTP酶中的作用

Rho特异鸟苷酸解离抑制因子（Rho- specific guanine nucleotide dissociation inhibitors, RhoGDIs）可以和RhoGTP酶结合形成复合物，来调节RhoGTP酶的活化状态，从而影响细胞的黏附、迁移、增殖等过程。RhoGDIs并不是简单的抑制RhoGTP酶，而是动态地调节RhoGTP酶的稳定、活化和循环。在本综述里，笔者将主要介绍RhoGDIs调节RhoGTP酶的活性、质膜穿梭以及竞争性作用的最新研究进展。

规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响

目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。

RhoGDI1在TNF-α诱导内皮细胞损伤中的作用研究

目的:阐明Rho特异鸟苷酸解离抑制因子1(Rho GDI1)和Rho/ROCK信号通路在肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导内皮细胞损伤中的作用机制。方法:采用siRNA技术干扰人脐静脉内皮细胞Rho GDI1表达,实验分为正常对照组,10μg·L^(-1) TNF-α处理组和Rho GDI1干扰组。MTT法检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测Rho GDI1、Rho A、ROCK表达及活化。结果:TNF-α处理和Rho GDI1干扰均显著降低内皮细胞存活率,提高内皮细胞的凋亡。TNF-α处理后Rho GDI1表达显著下降,TNF-α处理和Rho GDI1干扰均可显著提高Rho A表达以及ROCK活化。结论:TNF-α可能通过抑制Rho GDI1促进Rho/ROCK信号通路的活化,最终引起内皮细胞凋亡。

RhoGDI1通过抑制骨肉瘤细胞凋亡促进其顺铂耐药性的研究

目的探讨抑制Rho蛋白鸟苷酸解离抑制因子-1(RhoGDI1)的表达对骨肉瘤顺铂耐药性的影响。方法在骨肉瘤细胞中通过siRNA抑制RhoGDI1的表达(si-RhoGDI1-1、si-RhoGDI1-2组),CCK-8实验检测其对骨肉瘤细胞增殖和顺铂耐药性的影响,划痕实验和体外Transwell检测其对骨肉瘤细胞迁移及侵袭能力的影响,流式细胞术(FACS)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RhoGDI1对骨肉瘤细胞凋亡的影响。结果与si-Control组(转染无意序列)比较,si-RhoGDI1-1、si-RhoGDI1-2组骨肉瘤细胞的增殖速度明细降低(P<0.01),对顺铂的耐受性明显降低(P<0.01),迁移到下室的细胞数显著减少;划痕实验和FACS结果显示,与si-Control组比较,si-RhoGDI1-1、si-RhoGDI1-2组细胞的修复能力明显减弱(P<0.05、P<0.01),细胞凋亡率(P<0.01)和凋亡诱导因子Bax的表达水平明显升高(P<0.01)。结论RhoGDI1通过抑制骨肉瘤细胞凋亡促进骨肉瘤细胞顺铂耐受性。

RhoGDI2与β2肾上腺素能受体减敏的关系及机制研究

目的探讨Rho鸟苷酸解离抑制因子2（RhoGDI2）对气道平滑肌细胞B。。肾上腺素能受体（口zAR）减敏的关系。方法培养人气道平滑肌细胞，以RhoGDI2高表达质粒转染后，用Western blot法检测RhoGDI2的蛋白表达量，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞内腺苷-3’，5’-环化一磷酸（cAMP）的含量，并探究两者关系。检测转染后细胞膜表面B2AR蛋白表达量随时间的变化，及转染后G蛋白耦联受体激酶2（GRK2）、蛋白激酶A（PKA）磷酸化位点蛋白表达情况，再加入GRK2及PKA抑制剂后，用ELISA检测细胞内cAMP的变化。结果RhoGDI2高表达组与阴性对照组及空白组相比，高表达组平滑肌细胞内cAMP含量降低，差异有统计学意义，转染后24h、36h、48h、60h、72h气道平滑肌细胞膜表面8zAR蛋白表达量随转染时间的延长呈下降趋势；RhoGDI2高表达组的BzAR的355，356丝氨酸位点磷酸化水平高于345，346位丝氨酸位点磷酸化水平。RhoGDI2转染后加GRK2抑制剂组、RhoGDI2转染后加PKA抑制剂组与空白对照组相比，气道平滑肌细胞内cAMP含量降低，其中，RhoGDI2转染后加PKA抑制剂组与空白对照组相比差异有统计学意义，RhoGDI2转染后加GRK2抑制剂组与空白对照组相比差异无统计学意义。结论①RhoGDI2高表达可引起人气道平滑肌细胞β2AR的减敏。②RhoGDI2引起人气道平滑肌细胞膜表面β2AR的减敏是通过GRK2磷酸化β2AR起作用。

RhoGDI2的研究进展

Rho鸟苷酸解离抑制因子-2（RhoGDI2）是小G蛋白调节因子家族成员之-，调控多种小G蛋白的生物学活性。它对Rho蛋白有双重调节作用，并从上游调节鸟苷酸交换因子、GTP酶活化蛋白的活性。目前研究表明RhoGDI2影响肿瘤侵袭转移，在多种恶性肿瘤中的异常表达将参与肿瘤的发生发展。研究RhoGDI2将有助于加深对肿瘤侵袭转移机制的了解，为预防肿瘤转移提供特异性、多靶位的治疗方法。另外，RhoGDI2在β2肾上腺素能受体（β2AR）减敏的哮喘小鼠肺组织中高表达，研究RhoGDIz和β2AR的关系为临床防治肚AR减敏提供-个新的切入点和治疗方向。

^60 Coγ射线辐射致LyGDI断裂对K562细胞的延迟性凋亡作用

目的 采用不同剂量的60 Coγ射线照射人红白血病细胞系K562,探究鸟苷酸解离抑制因子-2（LyGDI）在细胞延迟性死亡中的作用以及其调控机制.方法 细胞流式仪PI单染检测细胞周期,藻红B染色观察细胞的凋亡,Western blot分析LyGDI和Rac1蛋白的表达,免疫荧光检测Rac1蛋白在细胞内的分布.结果 K562细胞被阻滞在G2/M期的百分率为71.3%,K562细胞早期凋亡率较低,8 Gy60Co γ射线照射后24 h,凋亡率为14%,呈现出延迟性的细胞凋亡;K562细胞在4 Gy的γ射线照射24 h后,可见LyGDI发生断裂,总的Rac1蛋白表达未发生明显变化,但其在细胞内的分布发生改变,Rac1转移至细胞膜上与少量核内分布,Rac1脱离LyGDI而激活.结论 LyGDI具有增加细胞延迟性凋亡的作用,其断裂使Rac1转移至细胞膜上,诱导Rac1的激活,从而促进了细胞的凋亡.