Identification of Secondary Structure of Extracellular Signal Regulated Kinase (ERK) Interacting Proteins and Their Domain: An in Silico Study

ERK is involved in multiple cell signaling pathways through its interacting proteins. By in silico analysis, earlier we have identified 22 putative ERK interacting proteins namely;ephrin type-B receptor 2 isoform 2 precursor (EPHB2), mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), interleukin-17 receptor D precursor (IL17RD), WD repeat domain containing 83 (WDR83), tescalcin (Tesc), mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4 (MAPP3K4), kinase suppressor of Ras2 (KSR2), mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MAP3K6), UL16 binding protein 2 (ULBP2), UL16 binding protein 1 (ULBP1), dual specificity phosphatase 14 (DUSP14), dual specificity phosphatase 6 (DUSP6), hyaluronan-mediated motility receptor (RHAMM), kinase D interacting substrate of 220 kDa (KININS220), membrane-associated guanylate kinase (MAGI3), phosphoprotein enriched in astrocytes 15 (PEA15), typtophenyl-tRNA synthetase, cytoplasmic (WARS), dual specificity phosphatase 9 (DUSP9), mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MAP3K1), UL16 binding protein 3 (ULBP3), SLAM family member 7 isoform a precursor (SLAMMF7) and mitogen activated protein kinase kinase kinase 11 (MAP3K11) (Table 1). However, prediction of secondary structure and domain/motif present in aforementioned ERK interacting proteins is not studied. In this paper, in silico prediction of secondary structure of ERK interacting proteins was done by SOPMA and motif/domain identification using motif search. Briefly, SOPMA predicted higher random coil and alpha helix percentage in these proteins (Table 2) and motif scan predicted serine/threonine kinases active site signature and protein kinase ATP binding region in majority of ERK interacting proteins. Moreover, few have commonly dual specificity protein phosphatase family and tyrosine specific protein phosphatase domains (Table 3). Such study may be helpful to design engineered molecules for regulating ERK dependent pathways in disease condition.

苦参碱调节RhoA-ROCK信号通路对冠心病模型大鼠Th17/Treg细胞平衡的影响

目的探讨苦参碱(Matrine)对冠心病(coronary heart disease,CHD)大鼠辅助T细胞17(helper T cell 17,Th17)/调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)细胞平衡及Ras同源基因家族成员A(RhoA)-Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)信号通路的影响。方法建立冠心病模型,将实验大鼠分为对照组、模型组、苦参碱低剂量(50 mg·kg^(-1))组、苦参碱高剂量(200 mg·kg^(-1))组及苦参碱高剂量(200 mg·kg^(-1))+LPA组(10 mg·kg^(-1))。超声心动图进行大鼠心功能检测;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法进行白细胞介素17(IL-17)、转化生长因子β(TGF-β)水平检测;流式细胞术检测Th17、Treg数量及Th17/Treg比值;免疫组化进行内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素1(ET-1)蛋白表达水平检测;Masson染色进行大鼠心肌组织的病理形态变化观察;TTC染色检测各组大鼠心肌梗死情况;TUNEL染色进行心肌组织中细胞凋亡情况检测;试剂盒检测RhoA活性;Western Blot法进行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平检测。结果与对照组比较,模型组心肌组织有大量蓝色胶原纤维沉积,左室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LVESV)、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA活性、RhoA、ROCK1、ROCK2表达水平明显升高,左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短分数(left ventricular shortening fraction,LVFS)、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,Matrine-L组、苦参碱高剂量组心肌组织蓝色胶原纤维逐渐减少,LVEDV、LVESV、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA活性、RhoA、ROCK1、ROCK2表达水平依次明显降低,LVEF、LVFS、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2表达水平依次明显升高(P<0.05)。与苦参碱高剂量组比较,苦参碱高剂量+LPA组心肌组织蓝色胶原纤维增多,LVEDV、LVESV、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA活性、RhoA、ROCK1、ROCK2表达水平明显升高,LVEF、LVFS、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2表达水平明显降低(P<0.05)。结论苦参碱通过抑制RhoAROCK信号通路调节Th17/Treg细胞平衡,改善冠心病大鼠心肌损伤。

生物钟基因BMAL1通过促进ROCK1调控滋养层细胞功能障碍的研究

目的 分析生物钟基因脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白类似蛋白1(BMAL1)对Ras同源物基因组成员A(RhoA)/Rho相关激酶1(ROCK1)信号通路的影响以及对滋养层细胞生物学功能的调控机制。方法 选择滋养层细胞系JEG3细胞,根据转染BMAL1过表达质粒以及添加1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L ROCK1抑制剂Y27632,分为对照组、BMAL1组、BMAL1+1μmol/L Y27632组、BMAL1+2μmol/L Y27632组、BMAL1+5μmol/L Y27632组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BMAL1、RhoA、ROCK1以及上皮-间充质转化(EMT)标记物N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail、Slug的mRNA表达水平;Western blot检测蛋白表达水平;CCK8法检测细胞的增殖活力;流式细胞术分别检测细胞周期、凋亡以及胞内活性氧(ROS)水平。结果 JEG3细胞过表达BMAL1后,与对照组相比,ROCK1 mRNA表达显著增加(P<0.01),RhoA mRNA表达增加但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,BMAL1组N-cadherin、Vimentin、Snail的mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。在蛋白水平,BMAL1组ROCK1、RhoA及Snail蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05),Y27632处理可以显著降低Vimentin及Snail蛋白表达(P<0.05)。此外,与对照组相比,BMAL1组细胞活力显著增加(P<0.001),BMAL1+Y27632各浓度组较BMAL1组细胞活力显著降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与对照组相比,BMAL1组细胞周期由G0/G1期向S+G2/M期转化,细胞总凋亡率有降低趋势但差异无统计学意义(P>0.05),胞内ROS水平显著降低(P<0.01);与BMAL1组相比,BMAL1+1μmol/L Y27632组和BMAL1+2μmol/L Y27632组细胞早期凋亡率及总凋亡率显著增加(P<0.05),BMAL1+1μmol/L Y27632组细胞ROS平均荧光强度增加但差异无统计学意义(P>0.05),BMAL1+2μmol/L Y27632组细胞ROS平均荧光强度较BMAL1组显著增加(P<0.001)。结论 生物钟基因BMAL1通过促进ROCK1表达参与调控滋养层细胞增殖、DNA合成、凋亡及氧化应激水平。

特发性膜性肾病患者血清ROCK2、renalase水平及其诊断价值

目的探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)、肾胺酶(renalase)在特发性膜性肾病(IMN)患者血清中的表达变化及其对IMN的诊断价值。方法选取2019年1月—2020年11月河北以岭医院肾病科收治IMN患者120例为IMN组,另选取同期医院进行健康体检的志愿者120例为健康对照组。酶联免疫吸附法(ELISA)检测受试者血清ROCK2、renalase水平,Pearson法分析ROCK2、renalase水平与部分临床指标的相关性;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清ROCK2、renalase及二者联合诊断IMN的价值。结果IMN组ROCK2、renalase水平均显著高于健康对照组(t/P=12.837/<0.001、11.066/<0.001)。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期IMN患者血清ROCK2逐次升高(F/P=77.154/<0.001),而Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期血清renalase水平逐次升高,但Ⅳ期血清renalase水平低于Ⅲ期(F/P=163.042/<0.001)。Alb与血清ROCK2、renalase水平呈负相关(r/P=-0.302/0.009、-0.402/<0.001),PLA2R抗体、BUN、SCr、24 h尿蛋白与血清ROCK2、renalase水平均呈正相关(r/P=0.336/<0.001、0.264/0.011、0.315/0.007、0.320/<0.001,0.359/<0.001、0.284/0.010、0.420/<0.001、0.412/<0.001);ROC曲线显示:血清ROCK2、renalase及二者联合诊断IMN的AUC分别为0.908、0.907、0.965,二者联合优于各自单独预测效能(Z=3.597,3.755,P均<0.001)。结论ROCK2与renalase在IMN患者血清中均高表达,二者联合诊断IMN的价值较高。

ROCK2和KLF6在急性缺血性脑卒中的表达变化及其与病情程度和预后的相关性

目的探究Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)和Krüppel样因子6(KLF6)在急性缺血性脑卒中(AIS)患者血清表达变化及其与病情程度和预后的相关性。方法选取2021年1月至2023年3月在我院确诊的117例AIS患者作为研究组,另选120例在我院同期体检健康者作为对照组。根据美国国立卫生院神经功能缺损(NIHSS)评分,将患者分为轻度(46例)、中度(40例)、重度(31例)组。根据改良Rankin量表将患者分为预后良好(74例)和预后不良(43例)组。酶联免疫吸附试验测定血清ROCK2和KLF6水平。Spearman分析ROCK2和KLF6水平与NIHSS评分的关系;多因素Logistic回归分析AIS患者预后不良的危险因素;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清ROCK2和KLF6水平对AIS患者预后不良的预测价值。结果与对照组相比,研究组ROCK2和KLF6水平显著增加(P<0.05)。与轻度组相比,中度组和重度组ROCK2和KLF6水平及NIHSS评分显著增加(P<0.05),与中度组相比,重度组ROCK2和KLF6水平及NIHSS评分显著增加(P<0.05)。相关性分析结果显示,ROCK2和KLF6水平与NIHSS评分均呈正相关(r=0.605,0.632,P<0.001)。与预后良好组相比,预后不良组患者ROCK2和KLF6水平显著增加(P<0.05)。ROCK2、KLF6单独及联合预测AIS患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.886(95%CI 0.822~0.949)、0.850(95%CI 0.770~0.930)、0.954(95%CI 0.919~0.988)。预后良好组与预后不良组患者总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平及NIHSS评分比较差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示TG水平、NIHSS评分、ROCK2和KLF6是AIS患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。结论AIS患者ROCK2和KLF6表达上调,其水平与病情程度及预后不良密切相关。

藁本内酯通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善脂多糖诱导小鼠肾足细胞损伤

【目的】探讨藁本内酯对脂多糖(LPS)诱导小鼠肾足细胞损伤的改善作用及机制。【方法】(1)体内实验:将小鼠随机分为空白对照组,LPS诱导组,藁本内酯低、高剂量组及藁本内酯高剂量+pcDNA-NC(RhoA阴性对照)组、藁本内酯高剂量+pcDNA-RhoA(RhoA过表达)组。除空白对照组,其他各组小鼠采用LPS诱导法构建急性肾损伤(AKI)模型。干预结束后,检测小鼠血清中尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平,高碘酸-希夫(PAS)染色法观察小鼠肾脏组织的病理变化,Western Blot法检测肾脏组织中RhoA、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)蛋白的表达。(2)体外实验:将培养的小鼠足细胞MPC5分为空白对照组,LPS诱导组,藁本内酯低、高剂量组,藁本内酯高剂量+pcDNA-NC组,藁本内酯高剂量+pcDNA-RhoA组,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测足细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,鬼笔环肽染色法分析细胞骨架,Western Blot法检测细胞RhoA、ROCK蛋白的表达。【结果】与空白对照组比较,LPS诱导组小鼠血清中BUN和Cr的水平、肾小管损伤评分、RhoA和ROCK蛋白表达水平升高(P<0.05);与LPS诱导组比较,藁本内酯低、高剂量组小鼠血清中BUN和Cr水平、肾小管损伤评分、RhoA和ROCK表达水平降低(P<0.05)。与空白对照组比较,LPS诱导组MPC5细胞增殖活性、F-肌动蛋白荧光强度、RhoA和ROCK的表达降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05);与LPS诱导组比较,藁本内酯低、高剂量组MPC5细胞增殖活性、F-肌动蛋白荧光强度、RhoA和ROCK的表达升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05)。利用过表达RhoA进行回补实验发现,RhoA过表达逆转了藁本内酯对LPS诱导小鼠肾组织和足细胞损伤的缓解作用(P<0.01)。【结论】藁本内酯可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善LPS诱导小鼠肾足细胞损伤。

藏红花素对脊髓损伤大鼠运动功能、炎症的影响及机制研究

目的 探讨藏红花素对脊髓损伤大鼠运动功能、炎症及Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路的影响。方法 构建脊髓损伤大鼠模型,将建模成功的48只大鼠随机分为模型组、藏红花素低(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)剂量组、甲泼尼龙琥珀酸钠(30 mg/kg)组,每组12只;另取12只大鼠作为假手术组。各组给予对应药物干预14 d(每天1次)。评估大鼠运动功能,并采用苏木素-伊红和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法染色分别观察脊髓组织病理变化和细胞凋亡,酶联免疫吸附试验法检测脊髓组织肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测脊髓组织RhoA、ROCK1、ROCK2信使RNA(mRNA)和蛋白水平。结果 假手术组大鼠脊髓组织结构正常,无明显变化;与假手术组相比,模型组大鼠脊髓组织出现坏死灶,伴随嗜伊红色素颗粒生成,可见较多胶质瘢痕及空洞,BBB评分显著降低(P<0.05),脊髓组织细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6、RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,藏红花素低、高剂量组大鼠脊髓组织病理损伤程度依次减轻,BBB评分依次升高(P<0.05),脊髓组织细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6、RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白水平依次降低(P<0.05);甲泼尼龙琥珀酸钠组和藏红花素高剂量组大鼠脊髓组织病理变化程度及各项指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 藏红花素能改善脊髓损伤大鼠运动功能,抑制脊髓组织细胞凋亡和炎症反应,其机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路的激活有关。

间充质干细胞外泌体调节哺乳动物雷帕霉素靶点/p70核糖体蛋白S6激酶/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白通路改善糖尿病肾病大鼠肾损伤的机制研究

目的探讨间充质干细胞外泌体(MSC-EVs)通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(S6K1)/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白(Beclin 1)通路改善糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的机制。方法采用高脂饮食联合腹腔链脲佐菌素(STZ)注射的方法建立SD大鼠DN模型,随机分为模型组、MSC-EVs组、MSC-EVs+MHY1485(mTOR激活剂)组,每组12只。另取12只SD大鼠以正常饲料喂养6周后,腹腔注射同等剂量柠檬酸钠溶液作为对照。以MSC-EVs和MHY1485分组处理后,检测大鼠血糖及肾功能指标[血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿微量白蛋白(UmALB)]水平。采用苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠肾组织病理形态;采用免疫组化检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路相关蛋白表达;采用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路及自噬相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠肾组织形态发生损伤,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,MSC-EVs组大鼠肾组织形态损伤减轻,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著升高(P<0.05);与MSC-EVs组相比,MSC-EVs+MHY1485组大鼠肾组织形态损伤加重,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05)。结论MSC-EVs可增强自噬,降低DN大鼠血糖、SCr、BUN和尿蛋白水平,减轻肾组织损伤,其机制可能与抑制mTOR/S6K1/Beclin 1通路激活有关。

Variations on conserved signaling pathways in biocontrol and development: G protein and MAPK genes of Trichoderma. atroviride and T. virens

Filamentous fungi employ conserved eukaryotic signaling pathway to detect and respond to environmental signals, including the presence of the host. Genetic experiment in which a particular signaling protein is lost, or its activity enhanced, have defined some of the function of heterotrimeric G proteins and MAP kinases in development and virulence. A hallmark of these studies is that orthologs in different species may have different functions. Antagonistic fungal-fungal interactions form the basis for biological control of plant disease. These interactions may employ novel modes of regulation by conserved signaling elements. Tag1, a G protein α subunit of Trichoderma. atroviride belonging to fungal Gi class, is involved in repression of sporulation and hyphal coiling(1). Deletion of ortholog of this gene, TgaA, in Trichoderma (Gliocladium) virens, however, did not affect sporulation and growth, yet tgaA mutants are unable to parasitize S. rolfsii sclerotia(2). Mutation of a second G α subunit gene is now under study. TmkA, a MAPK gene of T. virens, is involved in biocontrol properties and repression of conidiation(3). Using suppression-subtraction hybridization and other approaches, we are beginning to identify additional elements of the signaling cascades and their downsteam targets. The role of G protein and MAPK genes are sometimes specific to a particular host fungus or to parasitism of mycelia or sclerotia(2,3). Also of relevance to biocontrol, signal transduction pathway provide a means to alter the balance between sporulation, mycelial growth and hyphal coiling.

Desensitization of G-protein-coupled receptors induces vascular hypocontractility in response to norepinephrine in the mesenteric arteries of cirrhotic patients and rats

BACKGROUND: The increased β-arrestin-2 and its combination with G-protein-coupled receptors (GPCRs) lead to GPCRs desensitization. The latter may be responsible for decreased contractile reactivity in the mesenteric arteries of cirrhotic patients and rats. The present study is to investigate the machinery changes of α-adrenergic receptors and G proteins and their roles in the contractility of mesenteric arteries of cirrhotic patients and animal models. METHODS: Patients with cirrhosis due to hepatitis B and cirrhotic rats induced by CCl 4 were studied. Mesenteric artery contractility in response to norepinephrine was determined by a vessel perfusion system. The contractile effect of G protein-coupled receptor kinase-2 (GRK-2) inhibitor on the mesenteric artery was evaluated. The protein expression of the α 1 adrenergic receptor, G proteins, β-arrestin-2, GRK-2 as well as the activity of Rho associated coiled-coil forming protein kinase-1 (ROCK-1) were measured by Western blot. In addition, the interaction of α 1 adrenergic receptor with β-arrestin-2 was assessed by co-immunoprecipitation. RESULTS: The portal vein pressure of cirrhotic patients and rats was significantly higher than that of controls. The doseresponse curve to norepinephrine in mesenteric arteriole was shifted to the right, and EC 50 was significantly increased in cirrhotic patients and rats. There were no significant differences in the expressions of the α 1 adrenergic receptor and G proteins in the cirrhotic group compared with the controls. However, the protein expressions of GRK-2 and β-arrestin-2 were significantly elevated in cirrhotic patients and rats compared with those of the controls. The interaction of the α 1 adrenergic receptor and β-arrestin-2 was significantly aggravated. This interaction was significantly reversed by GRK-2 inhibitor. Both the protein expression and activity of ROCK-1 were significantly decreased in the mesenteric artery in patients with cirrhosis compared with those of the controls, and this phenomenon was not shown in the cirrhotic rats. Norepinephrine significantly increased the activity of ROCK-1 in normal rats but not in cirrhotic ones. Norepinephrine significantly increased ROCK-1 activity in cirrhotic rats when GRK-2 inhibitor was used. CONCLUSIONS: β-arrestin-2 expression and its interaction with GPCRs are significantly upregulated in the mesenteric arteries in patients and rats with cirrhosis. These upregulations result in GPCR desensitization, G-protein dysfunction and ROCK inhibition. These may explain the decreased contractility of the mesenteric artery in response to vasoconstrictors.

COPD合并肺动脉高压患者血清ROCK1、AgRP水平及临床意义

目的分析慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并肺动脉高压(PH)患者血清Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)、刺鼠相关神经肽(AgRP)水平及临床意义。方法选取2020年1月—2022年7月新疆医科大学第五附属医院呼吸与危重症科收治的COPD患者150例为COPD组,根据是否合并PH分为PH亚组39例和非PH亚组111例;另选取同期体检健康志愿者60例为健康对照组。检测受试人员血清ROCK1、AgRP、炎性因子[白介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平和肺功能[第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV_(1)%)、第1秒用力呼气容积/用力肺活量比值(FEV_(1)/FVC)]。采用Pearson/Spearman相关性分析COPD合并PH患者血清ROCK1、AgRP与肺功能指标和炎性因子的相关性,采用多因素Logistic回归分析COPD合并PH的影响因素,采用受试者工作特征曲线分析血清ROCK1、AgRP水平对COPD合并PH的评估价值。结果与健康对照组比较,COPD组血清ROCK1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平升高,AgRP水平和FEV_(1)%、FEV_(1)/FVC降低(t=26.657、26.350、15.690、12.567、15.987、17.235、27.639、26.348,P均<0.001)。与非PH亚组比较,PH亚组血清ROCK1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平升高,AgRP水平和FEV_(1)%、FEV_(1)/FVC降低(t=5.858、4.503、5.045、4.455、4.472、6.048、4.207、5.206,P均<0.001)。COPD合并PH患者血清ROCK1与FEV_(1)%、FEV_(1)/FVC呈负相关,与IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α呈正相关(r=-0.647、-0.689、0.672、0.656、0.710、0.624,P均<0.001);AgRP与FEV_(1)%、FEV_(1)/FVC呈正相关,与IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α呈负相关(r=0.627、0.705、-0.607、-0.601、-0.661、-0.610,P均<0.001)。FEV_(1)%高、FEV_(1)/FVC高、AgRP高为COPD患者合并PH的独立保护因素[OR(95%CI)=0.877(0.770~0.999)、0.820(0.710~0.946)、0.552(0.359~0.850)],IL-1β高、IL-6高、IL-8高、TNF-α高、ROCK1高为独立危险因素[OR(95%CI)=1.156(1.025~1.303)、2.011(1.160~3.485)、1.161(1.032~1.307)、1.107(1.025~1.197)、1.487(1.102~1.875)]。血清ROCK1、AgRP水平及二项联合预测COPD合并PH的曲线下面积分别为0.777、0.769、0.853,二项联合的AUC高于单项预测(Z/P=2.410/10.016、2.598/0.009)。结论COPD合并PH患者血清ROCK1水平降低和AgRP水平升高,与肺功能下降和炎性反应有关,ROCK1联合AgRP评估COPD合并PH的价值较高,可能成为其辅助诊断指标。

Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1在动脉粥样硬化血管壁中的表达及其与基质金属蛋白酶2及转化生长因子1的相关性

目的研究Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)在动脉粥样硬化血管壁中的表达及其与基质金属蛋白酶2(MMP2)、转化生长因子1(TGF-β1)的相关性。方法选择30只载脂蛋白E基因敲除小鼠为实验组,高脂饲料喂养,另选30只C57BL/6小鼠为对照组,普通饲料喂养。在喂养的第10、16、22、28及34周,取眼球血监测小鼠血脂水平;取小鼠腹主动脉作为标本,包埋切片并进行苏木精-伊红染色观察血管壁形态;应用免疫组化染色观察血管壁中ROCK1、MMP2、TGF-β1的表达;使用Image Pro Plus 6.0软件测量切片中血管壁厚度、斑块面积、血管壁中ROCK1、MMP2及TGF-β1的表达量。采用SPSS 27.0统计软件进行数据分析。采用单因素方差分析进行组间比较,两两比较采用Tukey检验。采用Pearson相关与线性回归分析ROCK1与血管壁厚度及斑块面积、MMP2、TGF-β1的关系。结果成功建立动脉粥样硬化小鼠模型。在喂养第10、16、22、28及34周,实验组血脂水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。自喂养第16周起,实验组小鼠血管内均有斑块形成,随着喂养时间的延长,斑块面积和血管壁厚度不断增加,差异有统计学意义(P<0.05);血管壁内ROCK1的表达逐步增高,其表达与斑块面积及血管壁厚度呈正相关(r=0.821,0.730;P<0.05)。线性相关分析及回归分析显示,ROCK1与MMP2、TGF-β1表达均呈正相关(r=0.801,0.906;P<0.05)。结论在动脉粥样硬化血管壁中存在ROCK1蛋白的表达,且表达量随着血管壁厚度增加而增高,ROCK1的表达与MMP2、TGF-β1呈显著正相关性。鉴于ROCK1蛋白的致血管痉挛作用,提示动脉粥样硬化血管壁可能易于痉挛,具体机制需进一步研究。

ROCK2在ARC中的表达及对晶状体上皮细胞的自噬及氧化损伤的影响

目的探讨Rho激酶2(ROCK2)在年龄相关性白内障(ARC)晶状体前囊膜中的表达及其对H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮细胞自噬及氧化损伤的影响。方法收集2020年6月~2021年4月在我院行超声乳化白内障吸出术的ARC患者20例,获取晶状体前囊膜,并获取眼科标本库中无眼科疾病、眼球结构完整且晶状体透明的正常晶状体前囊膜。免疫组织化学染色和Western blot检测ROCK2蛋白表达;将人晶状体上皮细胞HLE-B3随机分为对照组、H_(2)O_(2)组、sh-NC+H_(2)O_(2)组和sh-ROCK2+H_(2)O_(2)组,转染sh-NC或sh-ROCK2至对应组细胞,并用H_(2)O_(2)处理细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞转染效率,MTT法检测各处理组细胞增殖活性,透射电镜观察细胞内自噬现象,自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染细胞后观察自噬溶酶体和自噬体水平,Western blot检测细胞中自噬相关蛋白表达情况,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平,试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(MDA)含量。结果与正常组织比较,ARC中ROCK2表达增高(P<0.05);转染sh-ROCK2后成功下调了HLE-B3细胞中ROCK2表达水平(P<0.05);与对照组比较,H_(2)O_(2)处理细胞后,细胞增殖活性显著下降,自噬体明显增多,明显激活了自噬溶酶体和自噬体水平,Beclin-1蛋白相对表达量显著升高,LC3-II/LC3-Ⅰ比值显著上调,ROS水平显著上升,SOD和GSH-Px的活性均显著降低,MDA含量则显著升高(均P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,细胞转染sh-ROCK2后再用H_(2)O_(2)处理,细胞增殖活性显著提高,自噬体减少,自噬溶酶体和自噬体水平受到抑制,Beclin-1蛋白相对表达量显著降低,LC3-II/LC3-Ⅰ比值显著下调(均P<0.05),同时,细胞内ROS水平显著下降,SOD和GSH-Px的活性均显著升高,MDA含量显著降低(均P<0.05)。结论ROCK2在ARC晶状体前囊膜内高表达,下调其表达能够抑制H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮细胞过度自噬,减少氧化损伤。

绿茶提取物介导Rho/ROCK通路缓解脑梗死大鼠脑组织损伤的实验研究

目的:探讨绿茶提取物对Ras同源基因(Rho)/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)通路的调控作用及对脑梗死大鼠脑损伤的影响,初步探讨其作用机制。方法:用线栓法复制大鼠脑梗死模型,并随机分为假手术组、模型组、绿茶提取物组(200 mg/kg)、Rho抑制剂组(给予盐酸法舒地尔15 mg/kg)、Rho激动剂组(给予溶血性磷脂酸50 mmol/kg)、联合组(绿茶提取物+Rho激动剂),每组18只。给药结束后,观察大鼠行为变化;氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑梗死状况;尼氏及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的黏性末端标记(TUNEL)染色法观察神经元损伤及凋亡情况;鬼笔环肽染色观察神经元细胞骨架变化;透射电镜下观察神经突触结构变化;免疫组化法观察Rho阳性表达水平;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测Rho/ROCK通路蛋白、促神经生长因子[神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT3)]、神经生长抑制因子[轴突生长抑制因子(NogoA)、髓鞘相关蛋白(MAG)、切丝蛋白(cofilin)]、突触再生重塑相关蛋白[突触后致密物质(PSD-95)、突触素(SYP)等]蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积均增加,脑皮层神经元损伤和凋亡、突触小泡破裂融合等结构损伤及细胞骨架破坏严重,Rho/ROCK通路活化,及其介导的促神经生长因子表达降低,而神经抑制因子表达升高(P<0.05)。绿茶提取物及Rho抑制剂均可减轻脑皮层神经元损伤和凋亡、突触小泡破裂融合等结构损伤及细胞骨架破坏等病理损伤,降低神经功能缺损评分及脑梗死体积,抑制Rho/ROCK通路活化和神经抑制因子表达,促进促神经生长因子表达(P<0.05)。Rho激动剂可逆转绿茶提取物的上述作用(P<0.05)。结论:绿茶提取物可抑制Rho/ROCK活化,促进脑梗死后神经元及突触的再生及重塑,改善神经功能损伤,发挥脑保护作用。

山茱萸环烯醚萜苷对延缓大鼠脑动脉瘤进展的影响

目的 探讨山茱萸环烯醚萜苷(CLG)通过Ras同源基因家族蛋白(Rho)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶(Rock)信号通路对大鼠动脉瘤进展的影响。方法 选取50只雄性大鼠建立脑动脉瘤(CA)模型,48只造模成功大鼠随机分为模型组、CLG低剂量、中剂量和高剂量组(各12只),未造模大鼠取12只为对照组。CLG低剂量、中剂量和高剂量组灌胃100、150、200 mg·kg^(-1)的CLG溶液(蒸馏水配制),连续30 d,对照组及模型组给予等量蒸馏水。检测各组大鼠血压变化;ELISA法检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)水平;HE染色观察脑组织病理学变化;RT-PCR和Western blot检测大鼠脑组织Rho、Rock2 mRNA和蛋白表达情况。结果 与模型组比较,3组大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压、TNF-α、IL-1、IL-6、Rho、Rock2 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),与CLG低剂量组比较,CLG中剂量、高剂量组诸项指标水平降低(P<0.05),与CLG中剂量组比较,CLG高剂量组诸项指标水平降低(P<0.05)。结论 CLG可调节CA大鼠血压水平、降低炎性因子水平,在一定程度上抑制动脉瘤样扩张,可能与抑制Rho/Rock信号通路有关。

Rho/ROCK信号通路介导肾脏纤维化的机制研究进展

肾脏纤维化是几乎所有肾脏疾病进展至终末期肾病的共同病理改变,严重威胁人类健康。Rho/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路是生物体内广泛存在的经典信号通路,可通过调节骨架蛋白的聚合状态影响细胞收缩、黏附、迁移等生物学行为。Rho/ROCK信号通路的异常激活参与肾脏纤维化的发生发展,有望成为临床治疗肾脏纤维化的有效靶点。因此,深入研究Rho/ROCK信号通路介导肾脏纤维化发生发展的机制,可以为慢性肾脏病的临床诊治和新药研发提供思路。

IgA肾病患者血清Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2、视黄醇结合蛋白4表达水平及在评估病情和预测预后中的价值研究

目的检测IgA肾病(immunoglobulin A nephropathy,IgAN)患者血清Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(rho associated coiled coil containing protein kinase 2,ROCK2)、视黄醇结合蛋白4(retinol-binding protein 4,RBP4)表达水平,分析二者在评估患者病情及预测预后中的价值。方法选取2016年6月至2019年6月98例中国贵航集团302医院已确诊收治的IgAN患者为IgAN组,其中轻度IgAN 36例、中度IgAN 32例、重度IgAN 30例;同期选择在中国贵航集团302医院体检的健康者100名为对照组。酶联免疫吸附法检测血清中ROCK2、RBP4水平;采用Kaplan-Meier生存曲线分析ROCK2、RBP4表达水平与IgAN患者预后的关系;Pearson相关性分析ROCK2与RBP4表达相关性;受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析ROCK2、RBP4对IgAN的诊断价值;比例风险回归模型法分析IgAN患者预后的影响因素。结果IgAN组血清中ROCK2、RBP4表达水平分别为(24.25±5.31)μg/L、(59.70±9.43)μg/L,显著高于对照组的(15.57±4.16)μg/L、(32.14±7.82)μg/L,差异具有统计学意义(t=12.818、22.404,均P<0.001);轻度、中度、重度IgAN患者血清中ROCK2水平分别为(18.69±4.36)μg/L、(23.75±5.31)μg/L、(31.46±5.62)μg/L,RBP4表达水平分别为(45.37±7.86)μg/L、(62.48±8.12)μg/L、(73.94±8.65)μg/L。随着病情的加重,IgAN患者血清ROCK2、RBP4表达水平逐渐升高,差异具有统计学意义(F=51.854、102.234,均P<0.05);IgAN患者血清中ROCK2、RBP4表达水平与Lee氏分级、IgA/C3比值、病情程度有关(P<0.05);ROCK2、RBP4高表达组患者预后生存率分别为60.00%、74.19%,均显著低于低表达组的89.71%、91.67%,差异具有统计学意义(log rankχ^(2)=4.674,P=0.031);ROC曲线结果显示,血清ROCK2诊断IgAN的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.889,敏感度为80.61%,特异性为80.00%,截断值为18.79μg/L;RBP4诊断IgAN的AUC为0.986,敏感度为96.94%,特异性为95.00%,截断值为41.31μg/L;二者联合检测的AUC为0.997,敏感度为98.98%,特异性为94.86%。Pearson相关性分析显示,IgAN患者血清ROCK2与RBP4表达水平呈显著正相关(r=0.701,P<0.001);多因素比例风险回归模型法分析表明,IgA/C3(OR=2.683,95%CI:1.060~6.794)、ROCK2(OR=1.831,95%CI:1.027~3.264)、RBP4(OR=1.517,95%CI:1.104~2.084)均是IgAN患者预后生存的影响因素(均P<0.05)。结论ROCK2、RBP4在IgAN患者血清中高表达,二者与IgAN患者的临床病理特征、病情严重程度及预后关系密切,ROCK2、RBP4表达水平对IgAN的诊断具有一定的价值。

治疗慢性移植物抗宿主病新药ROCK2抑制剂Belumosudil

Belumosudil是一种Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶2的选择性口服抑制剂,该药于2021年7月16日获美国食品和药品监督管理局批准上市,用于治疗已接受过至少2种系统疗法治疗失败的慢性移植物抗宿主病儿童(年龄≥12岁)与成人患者。本文对belumosudil的作用机制、药动学、临床评价、安全性评价等进行评述。

2种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶对经皮冠状动脉介入治疗无复流的预测价值

目的探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)1和ROCK2对急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI)无复流的预测价值。方法选取168例接受PCI的STEMI患者作为研究对象,根据是否发生无复流分为无复流组和血流正常组,并分别根据ROCK1、ROCK2表达情况分为高表达组和低表达组。使用酶联免疫吸附试剂盒检测患者血清ROCK1、ROCK2水平,分析无复流组与血流正常组的血清ROCK1、ROCK2水平差异,分析STEMI患者PCI无复流的危险因素,并分析ROCK1、ROCK2对STEMI患者PCI无复流的预测价值。结果168例STEMI患者中,46例发生无复流,发生率为27.38%。无复流组的Killip分级、发病至入院时间、未使用预防性无复流药物者占比、血清ROCK1水平、血清ROCK2水平高于或长于血流正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。ROCK1高表达组的无复流发生率高于ROCK1低表达组,ROCK2高表达组的无复流发生率高于ROCK2低表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logsitic回归分析显示,Killip分级为Ⅲ~Ⅳ级、发病至入院时间较长、未使用预防性无复流药物、血清ROCK1水平较高、血清ROCK2水平较高均为STEMI患者PCI无复流的独立危险因素(P<0.05)。受试者工作特征曲线显示,ROCK1、ROCK2对STEMI患者PCI无复流的预测价值较高,且两者联用后预测价值提升,曲线下面积为0.789(95%CI:0.711~0.867)。结论血清ROCK1、ROCK2水平较高是STEMI患者PCI无复流的危险因素,两者联合检测对PCI无复流具有较高的预测价值。

TGF-β_1介导的RhoA/ROCK通路在大鼠肺肌成纤维细胞分化中的调节作用

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)介导的RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)通路在调控肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中的作用。方法:胰酶消化法获得原代培养的肺成纤维细胞,进行以下实验:(1)观察TGF-β1诱导肺成纤维细胞不同时间后p-RhoA、ROCK、磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基(pMBS)、血清应答因子(SRF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型和III型胶原蛋白表达变化;(2)将细胞分为对照组、TGF-β1诱导分化组和Y-27632(ROCK通路阻滞剂)干预组,免疫细胞化学染色与Western blotting法分别观察与检测ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型胶原蛋白在细胞内的定位分布与表达。结果:(1)经TGF-β1诱导24 h后,大鼠肺成纤维细胞胞体内出现大量平行或交叉排列的α-SMA抗体标记的肌丝。随着TGF-β1诱导刺激时间的延长,p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型胶原蛋白表达逐渐增高,其中RhoA/ROCK信号(p-RhoA、ROCK、p-MBS)、SRF和α-SMA蛋白分别在诱导后6 h、12 h和24 h达到高峰。I型胶原和III型胶原蛋白表达均在24 h达高峰,分别为诱导前的2.19和3.04倍(P<0.05)。(2)与TGF-β1诱导分化组比较,当给予Y-27632干预后,在相应时点ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型胶原蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β1通过ROCK信号转导通路的活化,刺激了大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,进而促进了胶原蛋白的合成,可能在(矽)肺纤维化形成过程中发挥着重要作用。