桃叶珊瑚苷调节RhoA/ROCK信号通路对胶质母细胞瘤细胞活力和上皮间质转化的影响

[目的]研究桃叶珊瑚苷(AU)对胶质母细胞瘤(GBM)细胞活力和上皮间质转化(EMT)的影响,并对其作用机制进行探讨。[方法]将U87细胞随机分为对照组、AU低浓度组、AU中浓度组、AU高浓度组、Y-27632组、AU高浓度+Y-27632组。细胞计数器试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、波形蛋白(Vimentin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)1、ROCK2表达。构建GBM裸鼠模型,随机分为裸鼠对照组、AU组、Y-27632组、AU+Y-27632组,测量肿瘤质量与体积,免疫组化法检测移植瘤组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达。[结果]GBM细胞活力随着AU浓度的升高而逐渐降低(P<0.05),选择U87作为后续实验细胞,选择10、25、50μmol/L浓度作为AU后续实验浓度。与对照组比较,AU低、中、高浓度组和Y-27632组细胞活力、迁移和侵袭细胞数、MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、RhoA、ROCK1、ROCK2表达显著下降,凋亡率、E-cadherin表达显著升高(P<0.05),其中高浓度AU和Y-27632组共同处理的细胞变化更显著(P<0.05)。AU和Y-27632均能抑制移植瘤质量和体积,降低RhoA/ROCK信号通路蛋白表达(P<0.05)。[结论]AU能抑制GBM细胞活力、迁移侵袭和EMT,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

苍术素调节RhoA/ROCK信号通路对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨苍术素(ATR)调节Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞恶性生物学行为的影响。方法:常规培养DLBCL细胞SUDHL-4,将其随机分为对照组、低浓度ATR组(ATR-L组,5μmol/L ATR)、中浓度ATR组(ATR-M组,10μmol/L ATR)、高浓度ATR组(ATR-H组,20μmol/L ATR)和高浓度ATR+RhoA激活剂U46619组(ATR+U46619组,20μmol/L ATR+10 nmol/L U46619)。CCK-8法测定细胞增殖活性。划痕实验检测细胞迁移能力。Transwell实验测定细胞侵袭能力。流式细胞术检测细胞凋亡率。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定细胞中RhoA、ROCK1 mRNA表达。免疫印迹法(Western blot)测定各组细胞B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、RhoA、ROCK1蛋白表达。结果:与对照组比较,ATR-M组、ATR-H组SUDHL-4细胞OD450值(48、72 h)、细胞迁移率、细胞侵袭数目、RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达降低,细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高(均P<0.05)。RhoA激活剂U46619减弱了ATR对DLBCL细胞恶性生物学行为的抑制作用。结论:ATR可能通过下调RhoA/ROCK信号通路抑制DLBCL细胞恶性生物学行为。

黄芩苷通过ROS依赖性调节RhoA/ROCK通路保护氯化钴诱导心肌细胞损伤的实验研究

目的:本研究旨在探讨黄芩苷(Baicalin)对氯化钴(CoCl_(2))诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的作用机制。方法:采用CoCl_(2)建立心肌细胞缺氧损伤模型,并分别加入不同浓度的黄芩苷培养。将正常氧培养设置为对照组,CoCl_(2)培养H9c2心肌细胞设置为CoCl_(2)组;Baicalin、Y27632(Rho激酶抑制剂)预处理的H9c2缺氧心肌细胞设置为CoCl_(2)+Baicalin组、CoCl_(2)+Y27632组、CoCl_(2)+Baicalin+Y27632组。通过细胞毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞活性;荧光探针测定细胞中活性氧(ROS)的表达;WST-8检测心肌细胞超氧化歧化酶(SOD)活力;TBA法测定丙二醇(MDA)浓度;同时采用WesternBlot方法分析RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达情况。结果:处理H9c2细胞24 h后,1 000μmol/L的CoCl_(2)和75μmol/L黄芩苷对治疗心肌细胞缺氧损伤具有较好的细胞活力。CoCl_(2)组细胞活性明显低于对照组,加入黄芩苷后可显著提高细胞活性(P<0.05);与对照组相比,CoCl_(2)组心肌细胞可上调ROS、MDA表达,下调SOD活力,升高RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,加入Baicalin后可逆转上诉蛋白的表达水平;与CoCl_(2)组相比,CoCl_(2)+Baicalin可抑制ROS、MDA的表达,上调SOD含量,下调RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,而加入Y27632(Rho激酶抑制剂)后则可显著增强Baicalin带来的保护作用。结论:Baicalin可减轻CoCl_(2)诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的炎症、氧化应激反应,其机制与抑制ROS依赖性RhoA/ROCK通路有关。

桃叶珊瑚苷调控RhoA/ROCK信号通路对胃癌MGC803细胞上皮间质转化和血管生成拟态的影响

目的:探究桃叶珊瑚苷(AU)调控RhoA/ROCK信号通路对胃癌MGC803细胞上皮间质转化(EMT)进程和血管生成拟态(VM)形成的影响。方法:常规培养人胃癌MGC803细胞,将其随机分为对照组、AU-L组(20μmol/L AU)、AU-M组(40μmol/L AU)、AU-H组(80μmol/L AU)、AU-H+RhoA激活剂水仙环素(Nar)组(AU-H+Nar组,80μmol/L AU+30μmol/L Nar)。采用CCK-8法、Transwell实验、细胞划痕实验分别检测不同浓度AU对细胞增殖、迁移和侵袭的影响,三维细胞培养法观察不同浓度AU对细胞体外VM管腔结构形成的影响,WB法检测AU对各组细胞RhoA、ROCK、VM与EMT相关蛋白表达的影响。结果:与对照组相比,AU-M组、AU-H组MGC803细胞增殖率(48、72 h时)、细胞迁移率、细胞侵袭数目、VM管腔结构数,以及RhoA、ROCK1、N-cadherin、vimentin、VE-cadherin的蛋白表达均显著降低(均P<0.05),E-cadherin表达显著升高(P<0.05);同时,使用Nar处理显著减弱了AU对MGC803细胞EMT和VM形成的抑制作用(均P<0.05)。结论:AU通过下调RhoA/ROCK信号通路抑制胃癌MGC803细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT和VM形成过程。

针刺人迎穴调控RhoA/ROCK1通路改善自发性高血压大鼠血压及血管损伤的机制研究

[目的]基于RhoA/ROCK1通路探讨针刺人迎穴对自发性高血压大鼠血压及血管损伤的作用机制。[方法]11周龄雄性自发性高血压大鼠,随机分为模型组、针刺组和西药组,选取同周龄雄性Wistar大鼠作为正常组。针刺组和西药组分别给予针刺人迎穴和厄贝沙坦灌胃给药。观察大鼠血压变化情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和ROCK1的表达水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测内皮素-1(ET-1)和人血小板衍化生长因子-AA(PDGF-AA)的mRNA和蛋白表达水平,免疫荧光检测颈动脉组织中基质金属蛋白酶2(MMP2)和RhoA的定位及表达水平。[结果]1)与模型组比较,西药组和针刺组在治疗3周,治疗6周时的平均动脉压有降低(P<0.05)。2)与模型组比较,西药组和针刺组在治疗6周时ET-1和PDGF-AA的mRNA和蛋白的表达均降低(P<0.05)。3)与模型组比较,西药组和针刺组在治疗6周时RhoA、AngⅡ和ROCK1的蛋白表达均降低(P<0.05),针刺组在治疗6周时MMP2的蛋白表达降低(P<0.05)。4)与西药组比较,针刺组在治疗6周时AngⅡ和ROCK1的蛋白表达均降低(P<0.05)。[结论]针刺人迎穴可能通过下调颈动脉RhoA/ROCK1通路来改善自发性高血压大鼠血压及血管损伤。

RhoA／ROK通路在糖尿病桥血管病变中作用机制的研究

目的 分析糖尿病（diabetes millitus，DM）对行冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypassgrafting。CABG）患者桥血管RhoA／ROK表达的影响及其RhoA／ROK通路在桥血管病变中的作用机制，为临床合理选择桥血管以及桥血管病变防治提供理论依据。方法选择行CABG患者14例，其中DM和非DM患者各7例，术中取其废弃的配对桡动脉（radial artery，RA）、乳内动脉（internalmammaryartery，IMA）、大隐静脉（greatsaphenousvein，GSV）。应用体外血管环灌流方法，检测配对RA、IMA、GSV对苯肾上腺素（phenylephrine，PE）、乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）及法苏地尔（fasudil）的反应。将配对RA、I—MA、GSV分别进行RhoA免疫组化及RhoA、ROKmRNA的RT—PCR检测。结果与非DM组比较，DM组GSV对PE收缩反应增强，对Ach和fasudil的舒张反应减弱，且差异均有统计学意义（P均〈0．05）；RA和IMA对PE、Ach和fasudil的反应在两组间差异均无统计学意义（P均〉0．05）；与非DM组比较，DM组GSV中RhoA表达增强，且差异具有统计学意义（P〈0．05），而IMA、RA、RhoA表达两组间差异均无统计学意义（P均〉0．05）。DM组GSVRhoA中ROKmRNA表达水平较非DM组显著升高且差异均有统计学意义（P均〈0．01）；RA、IMA中RhoA、ROKmRNA表达两组差异均无统计学意义（P均〉0．05）。结论DM时GSVRhoA／ROK表达增加，RA、IMA中RhoMROK表达无明显变化。

灯盏花乙素调节RhoA/ROCK信号通路对糖尿病肾病大鼠肾组织损伤的影响

目的:探讨灯盏花乙素(Scu)调节RhoA/ROCK信号通路对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织损伤的影响。方法:将SD大鼠随机选择10只作为对照组(Con),其余60大鼠构建DN模型,造模成功的大鼠按随机数字表法分为5组:DN组、Scu低剂量组(Scu-L组,25mg/kg)、Scu中剂量组(Scu-M组,50mg/kg)、Scu高剂量组(Scu-H组,100mg/kg)、Scu-H+LPA组(100mg/kg Scu+50μmoL/L的RhoA/ROCK信号通路激活剂LPA)。ELISA试剂盒法检测24h尿微量白蛋白(MAU)及血清生化指标;HE染色、Masson染色观察肾组织损伤情况;RT-qPCR及Western blot检测TGF-β1、VEGF、PTEN水平;Western blot检测RhoA/ROCK通路蛋白水平。结果:Con组大鼠肾小球形态结构正常;DN组肾小球形态结构异常,肾小管出现水肿以及坏死现象,鲍曼囊出现粘连现象且出现大面积的蓝染胶原纤维沉积;Scu处理后,肾小管水肿以及坏死现象减少,肾小球形态结构变得较为规则,鲍曼囊腔缩小,且蓝染胶原纤维沉积减小。与Con组相比,DN组FBG、BUN、Scr、MAU、IL-6、TNF-α、TGF-β1、VEGF mRNA及蛋白水平、RhoA、p-ROCK/ROCK蛋白水平均显著升高(P<0.05),PTEN mRNA及蛋白水平显著下降(P<0.05);Scu处理后,FBG、BUN、Scr、MAU、IL-6、TNF-α、TGF-β1、VEGF mRNA及蛋白水平、RhoA、p-ROCK/ROCK蛋白水平均显著下降(P<0.05),PTEN mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05),且Scu添加剂量越高,作用效果越明显;LPA消除了Scu-H组对DN大鼠的改善作用。结论:Scu可能通过下调RhoA/ROCK信号通路减轻DN大鼠肾组织损伤。

RhoA/ROCK信号转导通路介导高糖诱导的大鼠肝星状细胞的增殖和胶原合成

目的探讨RhoA/ROCK信号转导通路在高糖诱导大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖和胶原合成中的作用。方法将SD大鼠肝星状细胞株HSC-T6在1640培养基中培养24 h,实验设置对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(含25 mmol/L葡萄糖)、高渗透压组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高糖+法舒地尔(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)组。采用MTS法检测细胞增殖率;采用羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)试剂盒测定细胞上清中Hyp水平;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)测定Ⅰ和Ⅲ型前胶原mRNA的相对表达量;采用Western blot检测肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)和p38MAPK的磷酸化和总体水平。结果与对照组相比,高糖组MYPT1(0.270±0.007 vs 0.090±0.008,P<0.001)、ERK(0.851±0.027 vs 0.175±0.038,P<0.001)、JNK(0.869±0.037 vs 0.488±0.022,P<0.001)和p38MAPK(0.498±0.020 vs 0.144±0.011,P<0.001)磷酸化水平显著增高,HSC增殖率(A值)(2.372±0.098 vs 1.588±0.087,P<0.001)和Hyp水平(27.924±1.069 vs 17.643±0.112,P<0.001)显著增高,Ⅰ型前胶原mRNA(2.783±0.167 vs 1.004±0.008,P<0.001)和Ⅲ型前胶原mRNA(4.958±0.143 vs 1.098±0.014,P<0.001)表达显著上调。与高糖组相比,高糖+法舒地尔(25μmol/L、50μmol/L)组MYPT1(0.110±0.007,P<0.001;0.101±0.006,P<0.001)、ERK(0.473±0.025,P<0.001;0.223±0.031,P<0.001)、JNK(0.688±0.024,P=0.019;0.576±0.035,P<0.001)和p38MAPK(0.350±0.021,P=0.012;0.305±0.015,P=0.019)磷酸化水平显著降低,HSC增殖率(A值)(1.819±0.104,P<0.001;1.613±0.103,P<0.001)和Hyp水平(21.430±0.714,P<0.001;18.574±0.825,P<0.001)显著降低,Ⅰ型前胶原mRNA(1.580±0.154,P<0.001;1.167±0.157,P<0.001)和Ⅲ型前胶原mRNA(3.166±0.073,P<0.001;2.524±0.085,P<0.001)表达显著下调。高糖+法舒地尔12.5μmol/L组MYPT1、ERK、JNK和p38MAPK磷酸化水平及Hcy水平均显著高于高糖+法舒地尔25μmol/L组和高糖+法舒地尔50μmol/L组(P均<0.001),高糖+法舒地尔25μmol/L组显著高于高糖+法舒地尔50μmol/L组(P均<0.001)。结论RhoA/ROCK信号转导通路可能通过激活下游的MAPKs介导了高糖诱导的肝HSC的增殖和胶原合成,ROCK可能是防治糖尿病肝纤维化的新靶点。

内皮抑制素抑制RhoA/ROCK信号通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤实验研究

背景急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种由多种诱因引发的急性肺部炎症性疾病,目前无有效防治手段。内皮抑制素(endostatin,ES)可特异性抑制血管内皮细胞的增殖和迁移,广泛应用于肿瘤治疗中,但其在急性肺损伤中的作用尚不明确。目的探讨内皮抑制素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠急性肺损伤的影响及可能机制。方法将36只雄性C57BL/6小鼠随机分为6组,分别为对照组、LPS组(模型组)、ES干预组A(LPS+1 mg/kg ES 6 h)、ES干预组B(LPS+1 mg/kg ES 12 h)、ES干预组C(LPS+5 mg/kg ES 6 h)、ES干预组D(LPS+5 mg/kg ES 12 h),每组6只。LPS组:将LPS溶液(15 mg/kg)通过肺部液体定量雾化器装置递送至小鼠肺,作用24 h,建立小鼠急性肺损伤模型;对照组:在相同时间点以同样的方式递送等体积0.9%氯化钠注射液,作用24 h;ES干预组:LPS刺激小鼠24 h后,腹腔注射不同剂量(1 mg/kg或5 mg/kg)的ES注射液,分别作用6 h与12 h。观察各组小鼠肺组织形态学改变;测定肺系数变化;行苏木素-伊红染色病理学检查;酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中血管内皮生长因子水平;流式细胞术检测小鼠血清与肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6水平;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测小鼠肺组织细胞凋亡;免疫印记实验检测小鼠肺组织中Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family member A,RhoA)和Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil-forming protien kinase 1,ROCK1)的表达。结果与对照组比较,LPS组肺系数增大(P<0.01),肺损伤评分升高(P<0.01),肺组织凋亡细胞数增多(P<0.01),血清血管内皮生长因子水平升高(P<0.05),血清与BALF中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05),肺组织RhoA与ROCK1蛋白表达增加(P<0.05)。与LPS组比较,ES干预组D肺部炎性渗出浸润减少,肺间质水肿及肺泡结构破坏减轻,肺损伤评分降低(P<0.01),肺系数减小(P<0.01),肺组织凋亡细胞减少(P<0.01),血清中TNF-α、IL-6和VEGF水平均下降(P均<0.01),肺组织RhoA和ROCK1表达减少(P<0.05)。结论内皮抑制素可减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤,减少肺组织细胞凋亡,其降低肺毛细血管内皮细胞通透性和炎症反应的功能可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

逍遥散对肝郁脾虚证大鼠海马组织RhoA/ROCK2通路的影响

目的 探究肝郁脾虚证的生物学基础及逍遥散的作用机制。方法 采用慢性束缚应激方法建立肝郁脾虚证大鼠模型。72只SD雄性大鼠随机分为6组,正常组,模型组,氟西汀组(0.0018 g/kg),逍遥散高(16.7 g/kg)、中(8.35 g/kg)、低(4.175g/kg)剂量组,每组12只。造模结束后,ELISA法测定大鼠血清单丝氨酸蛋白激酶1(single serine protein kinase 1,LIMK1)的含量,荧光定量PCR、 Western blot检测海马组织RAS同源基因家族成员A(RAS homologous gene family member A,RhoA)、Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶2(Rho-related spiral coiled protein kinase 2,ROCK2)的m RNA及蛋白表达。结果 模型组大鼠血清LIMK1含量,海马组织中RhoA、ROCK2的mRNA和蛋白表达水平均明显高于正常组(P<0.01);各药物组大鼠血清LIMK1含量明显低于模型组(P<0.01),逍遥散高、中剂量组和氟西汀组大鼠海马组织中RhoA、ROCK2的mRNA和蛋白表达明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)。结论 慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠海马组织RhoA/ROCK2通路被激活,逍遥散可抑制RhoA/ROCK2通路激活,并且作用呈剂量依赖性。

蟾毒灵联合索拉非尼通过RhoA/ROCK/HIF1α通路抑制肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的机制

目的观察蟾毒灵联合索拉非尼对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭能力的干预作用及对Ras同源基因蛋白A(RhoA)/含Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)/缺氧诱导因子1α(HIF1α)通路相关蛋白表达的影响。方法取对数生长期的肝癌HepG2细胞,分别加入蟾毒灵、索拉非尼单药或联合处理24 h,CCK-8方法检测细胞增殖情况,明确后续实验药物干预浓度;将肝癌HepG2细胞分为空白对照组、蟾毒灵组、索拉非尼组、蟾毒灵联合索拉非尼组,空白对照组不进行任何处理,其余组加入相应药物培养24 h,观察肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭情况,Western blot法检测RhoA/ROCK/HIF1α通路相关蛋白表达情况。结果蟾毒灵、索拉非尼均可抑制肝癌HepG2细胞增殖,选择蟾毒灵4μg/mL、索拉非尼20μmol/L为后续实验干预浓度。各药物组肝癌HepG2细胞的迁移与侵袭率和索拉非尼组、蟾毒灵联合索拉非尼组肝癌HepG2细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、HIF1α蛋白相对表达量均明显低于空白对照组(P均<0.05),且蟾毒灵联合索拉非尼组肝癌HepG2细胞的迁移与侵袭率和各蛋白相对表达量均明显低于蟾毒灵组和索拉非尼组(P均<0.05)。结论蟾毒灵联合索拉非尼可通过调控RhoA/ROCK/HIF1α通路加强对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用,可能是两者联合使用抑制肝癌复发转移的潜在机制。

OSBPL2介导RhoA/ROCK2信号通路调控听觉细胞肌动蛋白细胞骨架

目的:探索氧化固醇结合蛋白样蛋白2(oxysterol binding protein-like 2,OSBPL2)对听觉细胞肌动蛋白骨架形态和功能的影响及其相关分子机制。方法:采用OSBPL2基因敲除(Osbpl2-KO)HEI-OC1细胞探讨OSBPL2缺陷对听觉细胞肌动蛋白细胞骨架形态和功能的影响;扫描电镜观察Osbpl2-KO小鼠毛细胞静纤毛形态;Western blot实验检测HEI-OC1细胞和耳蜗内Rho/ROCK信号通路关键效应因子Rho激酶2(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 2,ROCK2)、Lim激酶1(LIM domain kinase 1,LIMK1)、肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白1(actin depolymerizing factor/cofilin 1,ADF/CFL-1)的表达水平。结果:Osbpl2-KO HEI-OC1细胞微丝骨架中纤维肌动蛋白(F-actin)的分布明显减少,细胞外周微刺突和丝状伪足明显减少,细胞迁移能力明显减弱;扫描电镜下观察发现Osbpl2敲除导致小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛变短且排列紊乱;Western blot检测结果表明,在HEI-OC1细胞和小鼠耳蜗中OSBPL2-KO均导致RhoA/ROCK2信号通路的抑制。结论:在听觉细胞中OSBPL2介导的RhoA/ROCK2信号通路在维持肌动蛋白细胞骨架形态和功能的过程中发挥重要的调控作用。

基于RhoA/ROCK通路探讨赤芍总苷对心肌梗死大鼠心肌凋亡的影响

目的基于RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)通路探讨赤芍总苷(TPG)对心肌梗死(MI)大鼠心肌凋亡的影响。方法冠状动脉左前降支结扎法建立MI大鼠模型,模型成功24只随机分为MI组、TPG组、TPG+RhoA激活剂溶血磷脂酸(LPA)组,每组8只。观察大鼠一般情况;全自动生化分析仪检测心肌损伤指标肌酸激酶同工酶(CK)-MB、心肌肌钙蛋白(cTn)I、cTnT情况;苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织形态学情况;TUNEL、流式细胞术检测心肌组织细胞凋亡情况;免疫组化检测大鼠心肌组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3蛋白表达水平;Western印迹检测大鼠心肌组织中RhoA、ROCK蛋白水平。结果MI组心肌组织中出现大量的心肌细胞坏死现象,细胞核固缩、溶解现象明显,炎症浸润、纤维化现象严重;TPG组优于MI组,TPG+LPA组症状介于MI组和TPG组之间。与MI组相比,TPG组血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平,心肌组织TUNEL阳性细胞比例,细胞凋亡比例,caspase3蛋白阳性率,RhoA、ROCK蛋白水平明显降低(P<0.05);与TPG组相比,TPG+LPA组血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平,心肌组织TUNEL阳性细胞比例,细胞凋亡比例,caspase3蛋白阳性率,RhoA、ROCK蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论TPG通过抑制RhoA/ROCK通路实现对MI大鼠心肌凋亡的缓解。

补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤小鼠RhoA/ROCK通路的影响

目的探讨补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤小鼠小胶质细胞P2Y12受体介导的RhoA/ROCK炎症信号通路的影响。方法将C57BL/6J小鼠随机分为Sham组、MCAO组、BYHW-L(低剂量,6.5 g·kg-1)组、BYHW-H(高剂量,26 g·kg-1)组、BYHW-H+MRS2395组,构建大脑中动脉闭塞模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),通过Longa生物学评分、TTC染色评估小鼠神经功能损伤情况;通过免疫荧光双标染色法、qPCR方法检测小胶质细胞M1、M2表型极化情况;通过Western blot法检测P2Y12受体介导的RhoA/ROCK通路蛋白的表达情况。结果与MCAO组相比,补阳还五汤能改善脑缺血再灌注损伤小鼠的神经功能损伤(P<0.05)和减小梗死体积(P<0.05,P<0.01),增加小胶质细胞从M1型向M2型极化(P<0.05,P<0.01),抑制P2Y12受体蛋白表达(P<0.05,P<0.01),阻断P2Y12介导的RhoA/ROCK通路及通路下游的p38 MAPK磷酸化(P<0.05,P<0.01),抑制炎症损伤(P<0.05,P<0.01)。加入P2Y12受体抑制剂MRS2395未阻断补阳还五汤改善神经功能损伤及抗炎作用。结论补阳还五汤可通过P2Y12受体介导的RhoA/ROCK炎症信号通路改善小鼠脑缺血再灌注后的脑损伤,还可通过其他途径及通路发挥抗炎作用,但具体机制有待进一步探索。

基于RhoA/ROCK信号通路探讨人参皂苷Rg2对曲妥珠单抗引起的大鼠心功能及心肌细胞损伤的影响

目的:探讨人参皂苷Rg2对曲妥珠单抗引起的大鼠心功能和心肌细胞损伤的影响及RhoA/RhoA相关蛋白激酶(ROCK)信号通路在此过程中的作用。方法:将Wistar雌性大鼠随机分为对照组、曲妥珠单抗组(Trz组,50.4 mg/kg曲妥珠单抗)、曲妥珠单抗+人参皂苷Rg2干预组(Trz+Rg2组,50.4 mg/kg曲妥珠单抗+20 mg/kg人参皂苷Rg2)。将心肌细胞H9c2分为对照组、Trz组(100μg/mL Trz,37℃培养24 h)、Trz+Rg2组(100μg/mL Trz,37℃培养24 h后,于200μmol/L人参皂苷Rg2中37℃培养12 h)。给药结束后,采用超声诊断仪测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD),并计算左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(LVFS);检测大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6含量及心肌组织匀浆上清液与H9c2细胞培养上清液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;流式细胞术检测H9c2细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠心肌组织与H9c2细胞中Bax、Bcl-2和RhoA、ROCK蛋白表达。结果:与对照组比较,Trz组大鼠LVEDD、LVESD升高,LVEF、LVFS降低(P<0.05);血清CK-MB、LDH及TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05);大鼠心肌组织与H9c2细胞中MDA水平和RhoA、ROCK蛋白表达升高,SOD活性降低(P<0.05),H9c2细胞凋亡率升高,H9c2细胞中Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降(P<0.05)。与Trz组比较,Trz+Rg2组大鼠LVEDD、LVESD降低,LVEF、LVFS升高(P<0.05);血清CK-MB、LDH及TNF-α、IL-6含量降低(P<0.05);大鼠心肌组织与H9c2细胞MDA水平和RhoA、ROCK蛋白表达降低,SOD活性升高(P<0.05);H9c2细胞凋亡率降低,H9c2细胞中Bax蛋白表达下降,Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg2可能通过下调RhoA/ROCK信号通路表达,改善曲妥珠单抗引起的大鼠心功能受损及心肌细胞损伤。

阿魏酸钠经RhoA和Rho-kinase信号通路抑制小鼠肝纤维化的机制研究

目的:探讨阿魏酸钠对于四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的抑制机制。方法:将CL级昆明属小鼠随机分为正常对照组、CCl4-花生油模型组(模型组)、阿魏酸钠给药组(给药组),每组20只。模型组小鼠和给药组小鼠分别给予CCl4-花生油(1∶1,V/V)1ml/kg灌胃,正常对照组小鼠给予同等剂量生理盐水,三组均为1次/d,连续8周;从第9周开始,给药组小鼠给予阿魏酸钠20mg/kg灌胃,1次/d,连续给药4周。12周后,检测各组小鼠肝功能水平、肝影像学指标、病理变化及肝脏中RhoA、Rho-kinase的总体情况。结果:通过正常对照组、模型组及给药组的小鼠肝功能和肝纤维化指标等指标对比,发现阿魏酸钠能显著抑制小鼠肝纤维化程度。结论:阿魏酸钠可能通过调节RhoA和Rho-kinase信号通路抑制小鼠肝纤维化。

度洛西汀对神经病理性疼痛大鼠kindlin/integrin/RhoA通路及脊髓星形胶质细胞活化的影响

目的探讨度洛西汀对神经病理性疼痛大鼠脊髓星形胶质细胞活化的影响,以及与kindlin/整合素(integrin)/RhoA信号通路的关系。方法将60只SD大鼠随机分成5组:假手术组、模型组、度洛西汀低剂量组、度洛西汀中剂量组和度洛西汀高剂量组。除假手术组外,其余各组均采用慢性缩窄损伤诱导大鼠神经病理性疼痛。各组分别给予药物处理,检测机械撤退阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热撤退潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL);采用免疫组织化学检测脊髓GFAP蛋白表达水平;采用ELISA法检测脊髓炎性因子白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;采用Western blot法检测大鼠脊髓kindlin、integrin、RhoA蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠MWT、TWL显著降低(P<0.05),炎性因子IL-1β和TNF-α水平、GFAP及kindlin-1、integrin、RhoA蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,度洛西汀各剂量组大鼠MWT、TWL显著升高(P<0.05),炎性因子IL-1β和TNF-α水平、GFAP及kindlin-1、integrin、RhoA蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论度洛西汀可抑制星形胶质细胞活化和炎症反应,减轻神经病理性疼痛,其机制可能与kindlin/integrin/RhoA信号通路有关。

桡动脉、乳内动脉、大隐静脉中RhoA/ROKm RNA的表达与心血管危险因素的相关性

目的探讨桡动脉（RA）、乳内动脉（IMA）、大隐静脉（GSV）中RhoA／Rho激酶（ROK）mRNA表达的差异，以及心血管危险因素对其表达的影响。方法取14例CABG术中废弃的配对RA、IMA、GSV各5～10mm，用RT—PCR检测RhoA／ROK mRNA的水平。采用多元逐步回归分析心血管危险因素对3种桥血管中RhoA／ROK表达的影响。结果①RT—PCR：IMA与GSV比较，RhoA和ROK mRNA表达的水平无显著差异；但RA中RhoA和ROK mRNA表达的水平显著高于IMA（P〈0．01，P〈0．05）。②多元逐步回归分析显示，GSV中RhoA和ROK mRNA表达的水平与糖化血红蛋白呈显著正相关（r=0．642、r=0．692，P〈0．05）。3种血管中RhoA、ROK mRNA的表达与年龄、总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A1、载脂蛋白B、C反应蛋白、胰岛素、胰岛素抵抗及体质量指数均无显著相关。结论①RA、IMA、GSV管壁中RhoA／ROK mRNA的表达有差异，RA中Rho／ROK mRNA的表达明显强于IMA。②糖化血红蛋白可影响GSV中RhoA／ROK mRNA的表达。

α受体介导的雌二醇对大鼠结肠平滑肌细胞RhoA/ROCK通路的影响

目的:探讨17β-雌二醇(17β-estraial,E2)对大鼠结肠平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)RhoA/ROCK通路的影响。方法:体外分离培养Sprague-Dawley(SD)大鼠结肠SMCs。细胞免疫荧光双标法观察ROCK1、雌激素受体(ER)α与α肌动蛋白(α-SMA)共表达。不同浓度和不同时间E2刺激后,以反转录实时荧光定量qRT-PCR、Western blot检测RhoA、ROCK1表达。不同浓度ROCK抑制剂Y27632刺激后,Western blot检测E2对其下游蛋白表达情况。观察ER阻断剂ICI182780、牛血清白蛋白结合的E2(BSA-E2)、ERα激动剂PPT及ERβ激动剂DPN在E2影响RhoA、ROCK1表达的作用。构建ERα、ERβ的siRNA,观察E2刺激对转染后SMC中RhoA、ROCK1表达的影响。结果:细胞免疫荧光示结肠SMC上ROCK1与α-SMA共表达。50 nmol/L E2刺激24 h可显著抑制大鼠结肠SMC上RhoA、ROCK1表达(P<0.05)。Y27632可浓度依赖性抑制下游蛋白pMYPT1、p-CPI17、p-MLC表达。E2组及PPT组RhoA、ROCK1表达显著低于其他各组(P<0.05)。ERαsiRNA组可上调RhoA、ROCK1表达(P<0.05)。结论:大鼠结肠SMC上存在ROCK1,E2可抑制RhoA/ROCK通路表达,该作用由雌激素α受体介导。