基于RhoA/Rho信号通路探讨产妇子宫平滑肌组织Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平与产后出血的关系

目的:基于RhoA/Rho信号通路探讨产妇子宫平滑肌组织CPI-17(Thr38)、KCa3.1、Krüppel样因子4(KLF4)表达水平与产后出血的关系。方法:选择80例宫缩乏力性产后出血产妇为观察组,选择同期80例无产后出血产妇为对照组。采用肌条等长张力测定法检测离体子宫平滑肌的自发收缩活动力,以及加入Rho激酶抑制剂(Y-27632)后的子宫平滑肌收缩活动力。采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应法检测子宫平滑肌组织中RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA表达水平,采用蛋白质印迹法检测RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡ以及Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平。采用Pearson相关分析RhoA蛋白以及子宫平滑肌收缩活动力与Thr38、KCa3.1、KLF4的关系。结果:观察组的子宫平滑肌收缩活动力、收缩频率以及收缩幅度均低于对照组(P<0.05~P<0.01),加入Y-27632后,2组子宫平滑肌收缩活动力均低于加入前(P<0.05)。观察组RhoA/Rho信号通路相关mRNA以及蛋白(RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ)表达水平均低于对照组(P<0.01)。观察组Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平均低于对照组(P<0.01)。Pearson相关分析显示,子宫平滑肌RhoA/Rho信号通路相关蛋白、收缩活动力与Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平均呈正相关关系(P<0.05)。结论:宫缩乏力性产后出血产妇子宫平滑肌组织的RhoA/Rho信号通路以及Thr38、KCa3.1、KLF4表达下降,且与收缩能力降低呈正相关关系,共同参与产后出血的发生。

黄芩苷通过ROS依赖性调节RhoA/ROCK通路保护氯化钴诱导心肌细胞损伤的实验研究

目的:本研究旨在探讨黄芩苷(Baicalin)对氯化钴(CoCl_(2))诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的作用机制。方法:采用CoCl_(2)建立心肌细胞缺氧损伤模型,并分别加入不同浓度的黄芩苷培养。将正常氧培养设置为对照组,CoCl_(2)培养H9c2心肌细胞设置为CoCl_(2)组;Baicalin、Y27632(Rho激酶抑制剂)预处理的H9c2缺氧心肌细胞设置为CoCl_(2)+Baicalin组、CoCl_(2)+Y27632组、CoCl_(2)+Baicalin+Y27632组。通过细胞毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞活性;荧光探针测定细胞中活性氧(ROS)的表达;WST-8检测心肌细胞超氧化歧化酶(SOD)活力;TBA法测定丙二醇(MDA)浓度;同时采用WesternBlot方法分析RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达情况。结果:处理H9c2细胞24 h后,1 000μmol/L的CoCl_(2)和75μmol/L黄芩苷对治疗心肌细胞缺氧损伤具有较好的细胞活力。CoCl_(2)组细胞活性明显低于对照组,加入黄芩苷后可显著提高细胞活性(P<0.05);与对照组相比,CoCl_(2)组心肌细胞可上调ROS、MDA表达,下调SOD活力,升高RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,加入Baicalin后可逆转上诉蛋白的表达水平;与CoCl_(2)组相比,CoCl_(2)+Baicalin可抑制ROS、MDA的表达,上调SOD含量,下调RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,而加入Y27632(Rho激酶抑制剂)后则可显著增强Baicalin带来的保护作用。结论:Baicalin可减轻CoCl_(2)诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的炎症、氧化应激反应,其机制与抑制ROS依赖性RhoA/ROCK通路有关。

富氢水激活RhoA/Rho信号通路调节钙敏感性改善感染性休克大鼠肠系膜血管反应性

目的探讨富氢水改善感染性休克大鼠肠系膜血管反应性的作用机制。方法SD大鼠随机分为假手术组(sham)、感染性休克(Septic shock,SS)、富氢水(Hydrogen-rich water,HRS)。分别于休克后1h、2h、3h、4h、6h取肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA)制成血管环测定舒张反应性及钙敏感性变化;HE染色观察肠系膜上皮损伤;ELISA检测血浆中炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平;Western blot检测RhoA/Rho信号通路相关蛋白的表达。结果感染性休克发生2h后SMA血管反应性和钙敏感性逐渐降低,而HRS可以提升SS大鼠SMA血管反应性和钙敏感性;同时HRS可以改善SS大鼠肠粘膜上皮的病理损伤,抑制炎症反应,降低大鼠血浆中TNF-α、IL-1β及IL-6的水平;其调控机制与HRS激活RohA蛋白,促进MYPT-1磷酸化相关。结论HRS能调节SS大鼠SMA血管反应性,缓解肠系膜损伤,该作用可能与激活RhoA/Rho信号通路调节钙敏感性有关。

RhoA/Rho激酶信号通路与先天性尿道下裂发生的相关性研究

目的通过构建先天性尿道下裂模型和在体外培养雄性胎鼠尿道海绵体组织来探讨RhoA/Rho激酶信号通路在先天性尿道下裂发生中的作用。方法通过邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]灌胃法建立先天性尿道下裂大鼠模型,处死大鼠获得尿道海绵体组织后,免疫组化检测RhoA和p-RhoA蛋白表达,荧光定量PCR(qPCR)检测各组大鼠尿道海绵体组织中RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA的表达水平,Western blot检测各组大鼠尿道海绵体组织中RhoA,p-RhoA,MLCP(myosin light chain phosphatase),p-MLCP,MLC(myosin light chain),pMLC蛋白的表达情况。同时对胎鼠的尿道海绵体组织进行体外培养,使用RhoA/Rho激酶通路的抑制剂处理培养中的尿道海绵体组织,观察RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA的表达水平。结果成功构建了大鼠尿道下裂模型。免疫组化结果显示与对照组相比,先天性尿道下裂大鼠阴茎组织中p-RhoA表达明显增加。qPCR结果显示,先天性尿道下裂大鼠尿道海绵体组织中RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA表达水平明显高于对照组(均P<0.05)。Western blot结果显示,先天性尿道下裂大鼠尿道海绵体组织中p-RhoA、p-MLCP、p-MLC蛋白的表达水平较对照组均明显升高(均P<0.05)。体外培养尿道海绵体组织实验发现,RhoA/Rho激酶通路抑制剂可阻碍RhoA/Rho激酶信号通路激活,从而抑制RhoA、ROCK1、ROCK2的表达并减轻DEHP对雄性胎鼠尿道段组织正常发育的抑制作用。结论 RhoA/Rho激酶信号通路激活与先天性尿道下裂的发生有关,抑制RhoA/Rho激酶信号通路激活可降低RhoA、ROCK1和ROCK2表达从而促进尿道海绵体组织正常发育。

肝素对RhoA/Rho激酶信号通路激活致心肌肥厚的影响

目的探讨激活心肌细胞三磷酸肌醇受体（IP3R）是否能触发RhoA/Rho激酶介导的心肌肥厚信号通路及肝素的干预作用,阐明除经典信号传导通路之外的作用途径及干预方式。方法培养Wistar乳鼠心肌细胞,RT-PCR法检测应用三磷酸肌醇（IP3）刺激后RhoA、Rho激酶基因表达,Western blotting法检测IP3刺激后胚胎基因α-肌动蛋白（α-actin）、β主要组织相容性复合体（β-MHC）及即早基因（c-fos、c-myc）蛋白表达及肝素的干预作用。结果给予IP3（10^-7mmol/L）刺激心肌细胞IP3R,能明显激活心肌细胞RhoA/Rho激酶信号通路,促使心肌细胞的即早基因和胚胎基因表达（P〈0.05）,且随时间延长而作用明显,肝素可抑制上述作用（P〈0.05）。结论激活IP3R介导的RhoA/Rho激酶信号通路能显著地促使心肌细胞肥大,此信号通路不同于已知的G蛋白耦联受体介导的心肌肥厚信号转导途径,且肝素有望成为抑制心肌细胞生长的药物之一。

RhoA/ROCK信号通路与心血管系统疾病关系的研究进展

心血管疾病是中国人群死亡的主要原因,然而其发病机制尚不明确。研究发现,RhoA/ROCK信号通路与高血压、冠心病、心力衰竭、心律失常等疾病的发生和发展密切相关。ROCK抑制剂也为心血管疾病的治疗提供新的思路,现就RhoA/ROCK信号通路在心血管疾病中研究做一综述。

醛固酮通过激活RhoA/ROCK信号通路诱导大鼠肝星状细胞迁移

目的探讨醛固酮(ALD)诱导大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞迁移的作用及其机制。方法HSC-T6细胞分为阴性对照组、ALD单独处理组、安体舒通预处理组、Y27632预处理组。对照组仅用无血清DMEM培养,其余各组给予1 nmol/L ALD刺激24 h,但安体舒通和Y27632预处理分别在ALD刺激前,分别给予10 nmol/L安体舒通或Y27632预处理1 ho TransweU™实验观察细胞迁移情况、罗丹明标记的鬼笔环肽染色观察细胞纤维型肌动蛋白(F-actin)的分布、激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的变化;Western blot法检测细胞Rh。激酶通路上肌球蛋白轻链(MLC)、膜突蛋白(moesin)磷酸化水平。结果ALD处理的HSC-T6细胞迁移增加、F-actin数量增加、MLC和moesin蛋白的磷酸化增强。安体舒通和Y27632均可显著抑制以上作用并抑制MLC和moesin蛋白的磷酸化,两组的抑制效应无明显差别。结论ALD诱导的肝星状细胞的迁移可能与Ras同源蛋白A/Rh。相关卷曲蛋白激酶(RhoA/ROCK)信号通路的激活有关。

麝香通心滴丸对高血压大鼠血管内皮功能及Rho/ROCK信号通路的影响

目的探讨麝香通心滴丸对自发性高血压大鼠血管内皮的作用及其对Rho/ROCK信号通路的影响。方法SPF级自发性高血压大鼠20只及同类正常血压大鼠10只,随机分为正常血压组(对照组)、自发性高血压模型组(SHR组),麝香通心滴丸组(STX组),每组10只。观测各组大鼠血压变化;检测大鼠血清中一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血管中内皮素-1(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)含量;实时PCR检测血管组织中ET-1及VEGF mRNA的表达;利用Western blotting检测血管组织中Rho/ROCK信号通路相关蛋白RhoA、ROCK及MLC蛋白的表达。结果与SHR组比较,STX组大鼠血压明显降低;SOD活性及NO含量显著增加,而MDA水平却明显降低;ET-1及VEGF蛋白及mRNA水平明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);同时,与SHR组比较,STX组大鼠血管组织RhoA、ROCK及MLC蛋白表达明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论麝香通心滴丸对自发性高血压大鼠模型的血管内皮有保护作用,可能与抑制Rho/ROCK信号通路相关蛋白表达有关。

RhoA/Rho激酶信号途径在门静脉高压发病机制中的研究进展

门静脉高压(PHT)是肝硬化后期的一个重要并发症,其引起的上消化道出血、脾大、腹腔积液、侧支循环形成严重影响患者的生存质量。由于PHT发病机制复杂、肝内和肝外存在诸多矛盾,导致临床上缺乏有效治疗PHT的药物,这也是目前PHT治疗的瓶颈问题之一。因此,深入研究PHT的形成机制,开发安全有效、不良反应少的药物一直是该领域的研究热点。调节血管收缩的Rho A/Rho激酶信号途径异常可能是PHT形成的关键机制之一。该文总结了近年来Rho A/Rho激酶信号途径在PHT发病机制中的研究进展,旨在为开发治疗PHT的药物提供新思路。

低频电脉冲通过RhoA/Rho激酶信号通路在流产模型子宫内的影响

目的探讨低频电脉冲通过RhoA/Rho激酶信号通路在流产模型子宫内的影响。方法选取在河北省实验动物中心购入的30只雌性大鼠和15只雄性大鼠进行交配,将未怀孕的雌性大鼠分为正常组,怀孕的雌性大鼠随机分为模型组和低频电脉冲组,正常组的大鼠在处死前未接受任何治疗,模型组用于构建人工流产模型,低频电脉冲组采用电针疗法治疗。检测并比较3组宫内膜厚度、腺体数、纤维化面积比例、E-cadherin、β-catenin、CLDN1蛋白及Rho GTP酶激活蛋白(ArhGAP1)信使RNA(mRNA)、RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达水平,以及RhoA、ROCK1、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达水平。结果正常组、模型组、低频电脉冲组的大鼠各有10只。低频电脉冲组子宫内膜厚度高于模型组,子宫内腺体数多于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。正常组子宫内膜厚度高于模型组,子宫内膜腺体数多于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。正常组和低频电脉冲组子宫内膜纤维化面积比例低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组E-cadherin蛋白、β-catenin、CLDN1蛋白表达水平高于正常组,低频电脉冲组E-cadherin蛋白、β-catenin蛋白表达水平低于模型组,CLDN1蛋白表达水平高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组ArhGAP1 mRNA表达水平低于正常组,RhoA mRNA和ROCK1 mRNA表达水平高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。低频电脉冲组ArhGAP1 mRNA表达水平高于模型组,RhoA mRNA、和ROCK1 mRNA表达水平低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组RhoA蛋白、ROCK1蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表达水平高于正常组和低频电脉冲组(P<0.05)。结论人工流产后大鼠给予低频电脉冲可以抑制RhoA/Rho激酶信号,减少炎症反应和子宫内膜纤维化。

内皮-单核细胞激活多肽-Ⅱ增强血肿瘤屏障通透性的信号机制

目的探索内皮一单核细胞激活多肽-Ⅱ（endothelial monocyte activating polypeptide-II，EMAP-II）增强血肿瘤屏障（blood—tumor barrier，BTB）通透性的相关信号机制。方法采集出生3—5d的Wistar胎鼠的大脑皮质，应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后，接种于培养皿中进行脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）原代培养；将BMECs与C6脑胶质瘤细胞共培养，构建体外BTB模型；共培养后的BMEC被随机分成5组（每组6例）：对照组、EMAP-Ⅱ组、H7＋EMAP—11组、C3 exoenzyme＋EMAP-II组和C3exoenzyme＋H7＋EMAP—II组。测定跨内皮阻抗值和辣根过氧化物酶流量评估各组BTB通透性变化情况；Western blot法检测BMECs上紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达水平变化；免疫荧光法检测OC-cludin和ZO-1在BMECs上的分布与表达。Western blot法检测BMECs上肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）和磷酸化肌球蛋白轻链（phosphomyosin light chain，pMLC）的表达水平变化。结果与对照组相比较，EMAP-II组BTB的通透性明显增高，BMECs上occludin和ZO-1的表达水平明显降低，pMLC的表达水平明显增高；EMAP—II的上述作用受到蛋白激酶c（protein kinaseC，PKC）抑制剂H7或（和）RhoA抑制剂C3exoenzyme预处理的明显抑制。结论信号分子PKC和RhoA在EMAP—II增强BTB通透性过程中发挥着重要的作用，信号通路PKC—pMLC和RhoA—pMLC参与调控该过程。

消渴通痹方含药血清对高糖损伤后HUVEC细胞骨架及RhoA/ROCK信号通路的影响

目的:观察消渴通痹方含药血清对高糖损伤后人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)F肌动蛋白(F-actin)、Ras基因家族成员A(Ras homolog gene family member A,RHOA)、Rho相关蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinase, ROCK)蛋白表达的影响。方法:将高糖损伤后HUVEC模型分为高糖模型组、22.5 g/kg消渴通痹方5%、10%、15%含药血清组,另设正常对照组,应用免疫荧光法检测F-actin的动态变化,Western blot检测F-actin、ROCK、p-ROCK和RhoA蛋白表达。结果:高糖刺激HUVEC骨架蛋白F-actin聚集到细胞中央,形成大量的应力纤维;22.5 g/kg消渴通痹方5%、10%含药血清干预后能够改善F-actin的聚集状态,使F-actin重新分布在细胞周边。与正常对照组比较,高糖模型组F-actin积分光密度值升高,F-actin、p-ROCK、RHOA蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01),ROCK蛋白表达明显下调(P<0.05);与高糖模型组比较,22.5 g/kg消渴通痹方5%含药血清组F-actin积分光密度值明显降低,F-actin、p-ROCK、RHOA蛋白表达明显下调(P<0.05),ROCK蛋白表达明显上调(P<0.05);10%含药血清组F-actin积分光密度值明显降低、F-actin蛋白表达明显下调(P<0.01或P<0.05),RHOA、ROCK蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论:益气活血中药消渴通痹方可能通过抑制RHOA/ROCK信号通路的异常激活稳定或保护内皮细胞骨架。

RhoA／Rho激酶信号通路在脑出血后血红蛋白影响血脑屏障通透性中的作用

目的探讨脑出血后血红蛋白是否通过激活RhoA／Rho激酶（ROCK）信号通路导致血脑屏障通透性增加。方法70只雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组（10只1、假手术组（30只）和血红蛋白组（30只），后2组再按照观察时间点的不同分为6h、12h和24h3个亚组（每个亚组10只）。血红蛋白组采用颅内注入血红蛋白法建立大鼠脑出血模型。采用伊文思蓝浓度检测评估各组大鼠血脑屏障的通透性，采用干湿法测定各组大鼠血肿周围脑组织的水含量．采用免疫组化染色检测RhoA和ROCK2蛋白在各组大鼠血脑屏障的表达分布情况，采用荧光定量PCR测定各组大鼠脑中RhoA和ROCK2mRNA的表达情况。结果与假手术组和正常对照组相比．血红蛋白组6h、12h和24h伊文思蓝渗透量和脑组织含水量均明显升高，差异均有统计学意义（RO．05）。免疫组化染色结果显示：正常对照组血脑屏障内皮细胞RhoA和ROCK2未见明显表达，血红蛋白组血肿侧血脑屏障内皮细胞中RhoA和ROCK2呈棕黄色表达，主要表达于胶质细胞的细胞质：实时荧光定量PCR结果显示：与正常对照组和假手术组相比．血红蛋白组RhoAmRNA表达在6h、12h和24h时均明显增高，血红蛋白组ROCK2mRNA表达在6h和12h均明显增高．差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论脑出血后血红蛋白可能通过激活RhoA／ROCK信号通路引起血脑屏障通透性增加，进而参与脑水肿的发生发展。

右美托咪定减轻呼吸机相关性肺损伤模型大鼠肺组织损伤

目的探讨右美托咪定(DEX)对呼吸机相关性肺损伤(VILI)大鼠肺组织Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法建立VILI大鼠模型,将大鼠分为对照组(control组)、模型组(VILI组)、右美托咪定低、高剂量组(DEX-L、DEX-H组)、右美托咪定高剂量+溶血磷脂酸(LPA)组(DEX-H+LPA组)。测定大鼠肺组织湿/干质量比值(W/D);HE染色观察肺组织病理形态;ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平;TUNEL染色法检测肺上皮细胞死亡;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及RhoA、ROCK1表达水平。结果DEX可以减轻VILI大鼠肺损伤,降低肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达(P<0.05),升高Bcl-2表达(P<0.05);LPA可以促使大鼠肺损伤加重,肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达升高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05)。结论右美托咪定可能通过抑制RhoA/ROCK1通路保护大鼠呼吸机相关性肺损伤。

淫羊藿苷通过调节RhoA/ROCK信号通路改善AD神经元和树突损伤的机制

目的:观察淫羊藿苷对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路的作用,并探讨其改善神经元和树突损伤的作用机制。方法:通过对大鼠双侧侧脑室注射β样淀粉蛋白1-42(Aβ_(1-42),2.5 g·L^(-1))建立AD模型,并将大鼠分为模型组,淫羊藿苷低、中、高剂量组(0.03、0.06、0.09 g·kg^(-1)),另设空白组。空白组和模型组按10 mL·kg^(-1)的剂量灌胃等体积的生理盐水。采用Morris水迷宫评估大鼠的认知功能。采用尼氏染色观察大鼠海马CA1区病理形态。采用高尔基染色观察大鼠海马CA1区树突棘密度和树突长度。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠海马中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、RhoA、ROCK1和ROCK2的m RNA表达水平。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠海马中TNF-α、IL-1β、IL-6、RhoA、ROCK1和ROCK2的蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠逃避潜伏期显著增加(P<0.01),穿越平台次数和目标象限驻留时间显著减少(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷中、高剂量组大鼠逃避潜伏期减少(P<0.05,P<0.01),穿越平台次数和目标象限驻留时间增加(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,模型组大鼠海马CA1区神经元数量、树突棘密度和树突长度显著减少(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷中、高剂量组大鼠海马CA1区神经元数量、树突棘密度和树突长度增加(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,模型组大鼠海马中TNF-α、IL-1β、IL-6、Rho A、ROCK1、ROCK2的m RNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷中、高剂量组大鼠海马中TNF-α、IL-1β、IL-6、Rho A、ROCK1、ROCK2的m RNA和蛋白表达水平下降(P<0.05,P<0.01)。结论:淫羊藿苷改善AD认知功能、神经元和树突损伤可能与抑制Rho A/ROCK信号通路相关。

基于RhoA/ROCK信号通路研究消渴通痹方含药血清对高糖诱导的HUVEC屏障功能和细胞凋亡的影响

目的:探讨Rho相关蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinase, ROCK)抑制剂Y27632和消渴通痹方含药血清对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)屏障功能和细胞凋亡的影响。方法:制备消渴通痹方含药血清,将SD大鼠随机分为正常对照组和消渴通痹方22.5 g/kg组,每天灌胃1次,连续7 d。根据葡萄糖的浓度和消渴通痹方含药血清的浓度将实验分为正常对照组、高糖模型组、Y27632 10μmol/L组和消渴通痹方22.5 g/kg 5%、10%、15%含药血清联合Y27632 10μmol/L组。各组细胞传代8代~15代时,应用辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)检测HUVEC的单层通透性,流式细胞术检测HUVEC凋亡,Western blot检测闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1, ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)和Ras基因家族成员A (Ras homolog gene family member A, RhoA)、ROCK蛋白的表达。结果:与正常对照组相比,高糖模型组HRP吸光度、细胞凋亡率、RhoA、p-ROCK/ROCK的比值都显著升高,ZO-1、Occludin蛋白表达显著下调(P<0.01)。与高糖模型组相比,Y27632 10μmol/L组HRP吸光度、细胞凋亡率显著降低(P<0.01),ZO-1、RhoA蛋白表达显著上调(P<0.01);消渴通痹方22.5 g/kg含药血清联合Y27632组HRP吸光度、细胞凋亡率显著降低、RhoA蛋白表达显著下调(P<0.01),ZO-1、Occludin蛋白表达显著上调(P<0.01);10%、15%消渴通痹方22.5 g/kg含药血清联合Y27632组p-ROCK/ROCK的比值显著降低(P<0.01)。与Y27632组相比,消渴通痹方22.5 g/kg各浓度含药血清联合Y27632组HRP吸光度、凋亡率明显降低、RhoA蛋白表达明显下调(P<0.01或P<0.05);ZO-1、Occludin蛋白表达上调(P<0.05);15%消渴通痹方22.5 g/kg含药血清联合Y27632组p-ROCK/ROCK的比值降低(P<0.05)。结论:益气活血中药消渴通痹方能改善高糖诱导的HUVEC细胞屏障功能、降低内皮细胞凋亡、增加紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达,其机制可能与RhoA/ROCK信号通路有关。

梅毒螺旋体膜蛋白Tpp47通过RhoA／ROCK信号通路调控血管内皮细胞通透性

目的 探讨梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp47对血管内皮细胞通透性影响的调控机制。 方法 用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）构建细胞单层模型，重组蛋白Tpp47（rTpp47）直接与HUVEC单层模型混合培养，或RhoA/ROCK信号通路特异性抑制剂Y-27632预处理后再用rTpp47刺激HUVEC单层模型，以煮沸灭活的rTpp47处理HUVEC单层模型为阴性对照组，采用ELISA检测各组培养1、4 h时辣根过氧化物酶（HRP）流量，培养12 h用荧光染料罗丹明-鬼笔环肽染色细胞骨架系统，共聚焦显微镜下观察细胞骨架蛋白F肌动蛋白排列变化。用Western 印迹检测rTpp47与煮沸灭活的rTpp47分别处理HUVEC单层模型后细胞RhoA的表达水平。 结果 rTpp47刺激HUVEC单层模型1 h时HRP流量（0.81 ± 0.10）高于阴性对照组（0.39 ± 0.09），差异有统计学意义（P 〈 0.05），而此时Y-27632预处理组HRP流量（0.51 ± 0.10）与单用rTpp47刺激组及阴性对照组相比，差异无统计学意义（均P 〉 0.05）。培养4 h时，单用rTpp47刺激组HRP流量显著增加（2.31 ± 0.14），且高于Y-27632预处理组（1.21 ± 0.12）及阴性对照组（0.73 ± 0.12），差异有统计学意义（均P 〈 0.05），而Y-27632预处理组与阴性对照组之间差异无统计学意义。rTpp47刺激HUVEC后，与煮沸灭活的rTpp47作用HUVEC相比，细胞中RhoA表达增加。同时，rTpp47刺激细胞中骨架蛋白F肌动蛋白重排，在胞质中形成应力纤维，抑制剂Y-27632可部分抑制F肌动蛋白重排。 结论 梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp47可通过RhoA/ROCK信号转导通路调控血管内皮细胞通透性。

翻白草含药血清对高糖培养肾小管上皮细胞增殖作用及其对RhoA/ROCK信号通路的影响

目的:探讨翻白草含药血清对高糖培养小鼠肾小管上皮细胞增殖及其对转分化机制的影响。方法:制备各组大鼠含药血清;10%胎牛血清(FBS)-RPMI 1640培养基培养小鼠肾小管上皮细胞,传代培养后按3 000个/孔接种于96孔培养板,分为正常组、高糖组、厄贝沙坦组及翻白草组;加入相对应6%含药血清的高糖RPMI 1640培养基;培养12,24,48,60 h时分别观察各组细胞形态,并应用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组吸光度A;高糖培养24 h后应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组肾小管上皮细胞小G蛋白(RhoA),Rho蛋白激酶1(ROCK1),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和钙黏附蛋白-E(Ecadherin)蛋白表达情况。结果:高糖培养后肾小管上皮细胞由扁平不规则的多角形变为长梭形;加入相应含药血清干预后细胞呈扁平不规则的多角形;与正常组比较,12 h时高糖组肾小管上皮细胞呈明显增殖状态(P<0.05),24,48,60 h时增殖显著(P<0.01);与高糖组比较,12 h时翻白草组能抑制肾小管上皮细胞增殖(P<0.05),24,48,60 h时翻白草组抑制肾小管上皮细胞增殖作用显著增强(P<0.01);与厄贝沙坦组比较,48,60 h翻白草组能抑制肾小管上皮细胞增殖(P<0.05);与模型组比较,翻白草组E-cadherin蛋白表达显著增加,RhoA,ROCK1和α-SMA蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论:翻白草含药血清可以抑制高糖培养的肾小管上皮细胞增殖、抑制肾小管上皮细胞转分化,可能与RhoA/ROCK信号通路有关。

RhoA／Rho激酶信号通路在TGF—β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

目的 观察TGF—β1对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到RhoA／Rho激酶信号通路的影响，以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法原代培养人皮肤成纤维细胞，将第4代细胞用TGF—β1（10ng／ml）刺激后，分不同作用时间（0、3、6、24h）提取细胞内总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度，Western—blot检测a—SMA的表达水平；并用相同的方法检测不同浓度TGF—β1（0、2、10、50ng／ml）刺激人皮肤成纤维细胞后，a-平滑肌肌动蛋白（d—smoothmuscleactin，a—SMA）的表达水平。用RhoA／Rho激酶信号通路阻断剂Y-27632处理后，再用TGF—β1刺激，作为实验组，将未作处理的正常细胞作为空白对照组，Y-27632（10μmol／L）组作为阴性对照组，只用TGF-β（10ng／ml）刺激组作为阳性对照组，分别检测a-SMA的表达差异。使用ANOVA对蛋白表达量进行统计学分析，P〈0．05为差异有统计学意义。结果10ng／mlTGF-β按不同作用时间刺激人皮肤成纤维细胞后，a—SMA的表达量分别为：0h为1．0，3h为1．9±0．2、6h为2．1±0．1，24h为3．1±0．1。24h较其他3个时间点a-SMA表达量明显上升（n=4，P〈0．05）。不同浓度TGF—β1刺激人皮肤成纤维细胞后，a—SMA的表达量分别为：0ng／ml为1．0，2ng／ml为1．4±0．2，10ng／ml为3．2±0．1，50ng／ml为3．1±0．2。10ng／ml表达量明显高于0ng／ml和2ng／ml（n=4，P〈0．05），较50ng／ml差异无统计学意义（n=4，P〉0．05）。用Y-27632（10μmol／L）处理后，再用TGF—β1刺激，细胞的表型转化明显受到抑制，实验组a—SMA的表达量（1．2±0．2）较阳性对照组（2．9±0．1）明显降低（n=5，P〈0．05），与空白对照组（1．0）和阴性对照组（1．1±0．1）相比差异均无统计学意义（n=5，P〉0．05）。结论RhoA／Rho激酶信号通路参与了TGF—B。诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化过程。