Rhodococcus sp.R04细胞色素P450单加氧酶及CYP125A18与唑类药物的互作分析

红球菌(Rhodococcus sp.)R04基因组有15种细胞色素P450单加氧酶,其中CYP125A18与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和马红球菌(Rhodococcus equi)的CYP125有较高同源性。利用NCBI蛋白质数据库搜索同源序列,对Rhodococcus sp.R04的15种CYP450一级结构序列进行比对和系统发育分析;对CYP125A18基因进行了克隆表达,并用紫外分光光度法对蛋白质的光谱学特性以及与唑类药物互作情况进行分析。实验结果表明,Rhodococcus sp.R04 15种CYP450均含有保守的氨基酸序列和铁血红素催化中心。SDS-PAGE分析表明,CYP125A18分子量约为50 k D,CYP125A18还原态和CO结合后与CYP125A18氧化态的差示光谱表现为典型的CYP450光谱特性。CYP125A18与底物4-胆甾烯-3-酮结合后,血红素铁全部转变为高自旋状态;与唑类药物滴定后发生了II型光谱转变。解离常数表明,7种唑类药物与CYP125A18的亲和力由强到弱依次为酮康唑、益康唑、4-苯基咪唑、氟康唑、4-甲基-2-苯基咪唑、克霉唑、甲硝唑。上述发现对研究CYP125代谢胆固醇具有重要意义,同时为疾病耐药性研究及药物选择提供数据和理论支持。

红球菌-R04生物降解多卤代联苯的影响因素研究

研究了不同取代元素以及取代元素的数量、位置等因素对Rhodococcus sp.R04降解多卤代联苯的影响.结果表明,联苯苯环第4位上的氢分别被氟、氯、溴以及甲基基团取代后降解率由高到低依次为4-FB>4-CB≥4-MB>4-BrB;当取代元素相同时,随着取代原子数目的增加,多卤代联苯降解率降低;当取代元素及取代原子数目相同时,不同位置的取代对卤代联苯的降解影响较大,特别是2,6位取代会强烈抑制关键酶对卤代联苯的催化降解,导致降解率降低.

N端缺失的锰过氧化氢酶生理生化特性

【目的】在红球菌(Rhodococcus sp.)R04中发现了一种高表达,N端缺失的锰过氧化氢酶(Mn-CAT),为了明确其在活性氧(Reactive oxygen species,ROS)清除与多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)代谢中所起的作用,本文对其生理生化特性进行了研究。【方法】利用DNAMAN对Rhodococcus sp.R04与Rhodococcus sp.R1101Mn-CAT的核酸和蛋白序列进行比对。化学合成和PCR搭桥法获取Mn-CAT全长基因。分别构建了原核表达载体p ETm3c-Mn-CAT,p ETm3c-Mn CAT-C,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,得到重组菌p ETm3c-Mn-CAT/BL21,p ETm3c-Mn CAT-C/BL21。工程菌诱导表达后,粗酶液经Q-sepharose和硫铵沉淀进行纯化。构建了锰过氧化氢酶C端(Mn CAT-C)基因的敲除载体p K18mobsac B-ΔMn CAT-C,电击法转入Rhodococcus sp.R04。荧光极化测定ROS的含量,HPLC分析多氯联苯的降解率。【结果】与Rhodococcus sp.R1101Mn-CAT基因序列相比,Rhodococcus sp.R04Mn-CAT缺少N端(R1101的Mn-CAT序列长度为915bp,R04的Mn CAT-C序列长度为468bp)。获得了纯度较高的Mn CAT-C,SDS-PAGE分析表明分子量约为23 k Da。以H2O2为底物时,Mn CAT-CKm比Mn-CATKm大,约为0.02357mol/L。通过基因同源重组的方式,得到菌株R04的Mn CAT-C敲除菌株,与野生菌株相比,敲除菌株体内ROS浓度显著增高,生长速率和多氯联苯降解速率明显下降。【结论】发现了一种N端缺失的锰过氧化氢酶,该酶具有原酶的大部分活性,且可以清除体内的ROS。Mn CAT-C基因的缺失影响了菌株的生长速率和多氯联苯的降解速率。

红球菌R04苯甲酸转运相关膜蛋白RHOGL009301的生理功能

【目的】探究红球菌(Rhodococcus sp.)R04膜蛋白RHOGL009301的生理功能和突变菌株的代谢特性,确定该膜蛋白的生理功能与苯甲酸转运的关系。【方法】将RHOGL009301基因与绿色荧光蛋白基因在Rhodococcus erythropolis进行融合表达,Delta Vision观察该基因蛋白产物的定位。通过基因同源重组敲除RHOGL009301基因,并对比野生型菌株和缺陷型菌株在不同碳源培养下的生长情况。HPLC测定红球菌R04野生型菌株和缺陷型菌株代谢联苯和苯甲酸时细胞内外代谢物,分析不同生长条件下代谢物的浓度变化。【结果】RHOGL009301基因与绿色荧光蛋白基因在Rhodococcus erythropolis中实现共表达,并定位在细胞膜上。获得了RHOGL009301基因的缺陷型菌株R04ΔMP,与野生型菌株相比,缺陷型菌株在联苯和苯甲酸培养条件下的生物量明显降低,生长速度减慢。HPLC分析表明RHOGL009301基因的缺失抑制了苯甲酸的转运。【结论】膜蛋白RHOGL009301是苯甲酸代谢和转运相关的蛋白,基于序列同源性分析,该膜蛋白是一种新型的苯甲酸转运蛋白。

苯酚降解菌CM-HZX1菌株的分离、鉴定及降解性能研究

从污水处理厂的活性污泥中分离出一株以苯酚为唯一碳源生长的高效降解苯酚菌CM-HZX1.通过形态特征、生理生化及16S r DNA基因序列分析,初步鉴定菌株属于红球菌(Rhodococcus sp.),16S r DNA在Gene Bank的登录号为KM014567.实验结果表明,菌株CM-HZX1培养及降解苯酚的最适条件为p H=7.0,温度30℃,转速为150 r·min^(-1).该菌株能耐受4%的盐度,适应性强.0.5 g·L^(-1)苯酚在24 h时的降解率可达93.6%,1.5 g·L^(-1)苯酚在48 h时的降解率在90%以上.研究表明,该菌株在处理工业含酚废水方面具有广阔的应用前景.

一株高效不对称还原产生(R)-苯基乙二醇的菌株筛选、鉴定及全细胞催化体系

R）-苯基乙二醇是合成许多光学活性药物的重要手性中间体，其制备具有重要的现实意义. 以α-羟基苯乙酮为底物，从土壤中筛选得到一株能够立体选择性催化α-羟基苯乙酮产生（R）-苯基乙二醇的细菌菌株HBU-SI7. 经形态学观察和16S rDNA序列分析，鉴定此转化菌株为红球菌属菌株Rhodococcus sp. 菌株全细胞催化体系研究表明在邻苯二甲酸二丁酯-磷酸盐缓冲液（V：V = 1：3）的两相催化体系下，菌体转化α-羟基苯乙酮的最优浓度为3.0 g/L，转化率高达96.2%，e.e值为99.3%. 本研究建立的红球菌全细胞催化还原体系对（R）-苯基乙二醇的高效制备具有潜在的研究和应用价值. （图6 表2 参20）

红球菌R04联苯/多氯联苯代谢相关调控蛋白RHOGL007659的生理功能

【目的】研究红球菌(Rhodococcus sp.)R04调控蛋白RHOGL007659的生理功能及其缺陷菌株的代谢特性,初步探究红球菌R04降解联苯的调控机制。【方法】通过基因同源重组敲除红球菌R04联苯代谢相关基因RHOGL007659。比较红球菌R04(野生型)和缺陷型菌株R04Δ7659(基因RHOGL007659缺陷型的R04)在不同碳源培养下的生长情况,HPLC分析R04和R04Δ7659转化联苯的能力。提取R04和R04Δ7659的总RNA,实时荧光定量PCR检测联苯降解关键基因的转录表达。纯化Bph B(联苯降解脱氢酶)和Bph D(联苯降解水解酶),制备多克隆抗体。Western blot分析Bph B和Bph D蛋白在R04和R04Δ7659中的表达水平。【结果】获得了RHOGL007659基因的缺陷型菌株R04Δ7659,与R04相比,R04Δ7659在联苯培养条件下的生物量趋近于零。HPLC分析表明,RHOGL007659基因的缺失使红球菌R04丧失转化联苯的能力。实时荧光定量PCR结果表明,在联苯培养条件下,缺失RHOGL007659后的R04,其联苯降解关键基因均有不同程度的下调表达。Western blot分析显示RHOGL007659缺失后,联苯降解关键酶Bph B和Bph D表达量均降低,这与实时荧光定量PCR结果相一致。【结论】RHOGL007659是红球菌R04联苯降解关键基因簇的调控蛋白,该蛋白对红球菌R04代谢联苯过程具有正调控作用。