比利时杜鹃花类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因克隆及功能分析

【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎、叶为实验材料,从比利时杜鹃花转录本数据库中筛选类黄酮生物合成通路关键酶类黄酮3’-羟化酶基因序列信息并进行生物信息学分析,利用反转录(RT-PCR)技术克隆RhF3’H基因;利用紫外分光光度计测定了比利时杜鹃花花瓣不同时期的花青素含量,利用RT-qPCR技术对不同发育时期花瓣和成熟期的不同组织进行RhF3’H基因表达量分析;采用Gateway技术构建过表达载体35S:RhF3’H-GFP重组载体进行亚细胞定位验证;构建p1302-RhF3’H过表达载体对比利时杜鹃花花瓣进行侵染。【结果】成功获得比利时杜鹃花RhF3’H基因长度为1557 bp,编码518个氨基酸,具有保守的F3’H结构域,属于P450超家族;系统进化树分析显示,比利时杜鹃花RhF3’H与龙眼和荔枝F3’H蛋白亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,RhF3’H在比利时杜鹃花不同花瓣时期和根、茎、叶组织中均有表达,在不同花瓣发育时期中,盛开期和衰败期中RhF3’H基因的表达量较高,与花青素含量结果相一致;亚细胞定位分析显示,RhF3’H主要存在于细胞膜上;成功构建P1302-RhF3’H瞬时过表达载体,相较于CK和p1302,p1302-RhF3’H在杜鹃花花瓣中显著高表达,其花青素含量也显著增加。【结论】RhF3’H基因在花瓣细胞膜中表达,表达模式与花青素积累趋势一致;过表达RhF3’H基因促进了花青素的合成。

比利时杜鹃花 RhDFR 基因克隆及分析

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是植物花青素合成过程中的关键酶,能够催化二氢黄酮醇生成无色花青素。该试验以红色和白色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同器官和不同发育时期的花瓣为实验材料,利用反转录(RT-PCR)和RACE技术克隆RhDFR基因,利用植物酶联免疫试剂盒(ELISA)测定不同发育时期的花瓣RhDFR酶活性,利用qRT-PCR技术定量分析不同器官和不同发育时期的花瓣RhDFR基因,构建pET-28a-RhDFR原核表达载体对RhDFR蛋白进行制备和纯化,为进一步探究杜鹃花DFR基因功能以及花色的分子机理奠定基础。结果表明:(1)成功获得比利时杜鹃花RhDFR基因全长1253 bp,其开放阅读框1035 bp,编码344个氨基酸,含有1个NADPH结合保守基序和1个底物结合区域,具有高度保守性;系统进化分析显示,比利时杜鹃花RhDFR蛋白与越橘(Vaccinium corymbosum)DFR蛋白亲缘关系最近。(2)ELISA试剂盒分析显示,比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣DFR酶活性呈先上升后下降的趋势,并于红花初开期和白花盛开期的DFR酶活性最高。(3)qRT-PCR分析显示,不同器官中RhDFR基因的表达量为花瓣最高,雄蕊最低;不同发育时期的花瓣中,红色花的RhDFR基因表达量高于白色花。(4)成功构建原核表达载体pET-28a-RhDFR并诱导表达出大小约为38 kD的蛋白,与理论值相近。研究认为,杜鹃花中DFR酶活性的功能多样化,DFR基因与比利时杜鹃花花瓣的颜色有关。

比利时杜鹃与爆杖花杂交亲和性研究

以比利时杜鹃‘西玛’为母本,野生杜鹃爆杖花为父本,通过常规授粉、NAA涂抹柱头、重复授粉、切割柱头、加热花粉、延迟授粉6种授粉方式进行杂交,授粉后对花粉管进行荧光观察,统计子房膨大率、坐果率、蒴果种子数、萌发率、绿苗率等亲和指标,探讨授粉方式对亲和性的影响,最后对该组合进行亲和性评价。结果表明:常规授粉未获得后代,在对杂交亲和性的分级评定中,杂交后代的绿苗率、绿苗系数和单位可育种子数均为低等,可育性综合评价为不育型。采用NAA涂抹柱头法、重复授粉法、加热花粉法、延迟授粉法均能有效提高比利时杜鹃‘西玛’×爆杖花组合杂交成功率。

比利时杜鹃花花青素合成酶基因(RhANS)克隆及其功能分析

花青素合成酶(ANS)是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录(RT-PCR)和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱(Waters UPLC-Qtof)技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体(pET-28a)上,并在大肠杆菌(BL21)中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱(HPLC)检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1350 bp,开放阅读框(ORF)序列1074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官(根、茎和叶)中均表达。不同花发育时期RhANS表达量与花青素含量呈上升趋势;通过大肠杆菌原核表达载体诱导表达出大小约为40 kDa的蛋白,与理论值相近。高效液相色谱仪(HPLC)检测表明,目的蛋白具有ANS酶活性。本研究为杜鹃花中花青素生物合成的分子调控机理提供了理论依据。

3种园林植物耐寒性的研究

[目的]测定西鹃、小蜡、南洋杉3种植物的半致死温度,为各地园林应用提供理论参考。[方法]电导法配合Logistic方程,通过DPS9.5统计软件进行非线性回归分析确定半致死温度;采用茚三酮比色法,测定叶片游离脯氨酸含量。[结果]用电导法配合Logistic方程计算小蜡、西鹃、南洋杉半致死温度,分别为-7.12、-8.61、-6.03℃。[结论]自然生长的成年小蜡、西鹃、南洋杉在不同休眠时期耐寒能力有一定差异。

高温胁迫下西洋杜鹃的生理响应及耐热性

以西洋杜鹃‘铁红’、‘粉红’、‘梅红’、‘普红’4个品种(系)扦插苗为试材,分别在38℃/28℃(昼/夜)和43℃/32℃(昼/夜)下胁迫4 d,之后转入25℃/22℃(昼/夜)恢复,以研究不同高温下西洋杜鹃的耐热性及其叶片对高温胁迫的生理生化响应。结果表明,在43和38℃胁迫下,植株遭受严重形态伤害,43℃胁迫对植株造成伤害的速度和程度明显大于38℃。相对电导率、MDA含量和氧自由基含量随胁迫时间延长、胁迫温度升高而增加;叶绿素含量变化趋势则相反;可溶性蛋白含量和SOD活性呈现先升后降趋势;脯氨酸含量在胁迫4 d后与初始值相比并无显著差异,不适合应用于西洋杜鹃的耐热品种筛选。对7个单项指标的耐热系数进行主成分分析,可溶性蛋白、MDA和相对电导率3项指标的累积贡献率达96.8%。耐热性综合评价,4个供试品种(系)耐热性顺序为:‘铁红’>‘普红’>‘梅红’>‘粉红’。

高温胁迫对西洋杜鹃光合作用和叶绿素荧光动力学参数的影响

以西洋杜鹃铁红、粉红、梅红、普红4个品种(系)的扦插苗为试验材料,分别在38℃/28℃和43℃/32℃(昼/夜)胁迫4 d后转入25℃/22℃(昼/夜)恢复,研究不同高温对西洋杜鹃光合作用和叶绿素荧光动力学参数的影响.结果表明:高温加重了光合作用光抑制,4个品种(系)的净光合速率(Pn)都下降,气孔导度随着处理时间的延长均显著下降;胞间二氧化碳浓度随着处理时间的延长均显著升高;蒸腾速率随着处理时间的延长则表现出先升高后下降的趋势.非气孔因素是导致西洋杜鹃光合作用下降的主要因素.4个品种(系)之间对高温胁迫的反应存在差异.铁红受高温的影响相对较小,Pn在4个品种(系)中的下降幅度最小;而普红Pn的变化受高温的影响最大.在叶绿素荧光动力学参数方面,高温胁迫4 d后,4个品种(系)的原初光能转换效率、光合电子传递量子效率、光化学猝灭系数和非光化学猝灭系数均显著下降.在恢复试验中,38℃组仅有少量植株存活,而43℃组则无一植株存活,表明在38和43℃胁迫下所产生的光抑制,已导致光系统Ⅱ结构在短期内受到了不可恢复的伤害或失活.

西洋杜鹃花蕾离体培养再生植株与工厂化育苗

以西洋杜鹃带梗小花蕾为外植体,研究了离体培养再生植株与工厂化育苗技术,试验结果表明:在ER+ZT6mg·L-1+IAA1mg·L-1固体培养基中诱导不定芽,诱导率高达94%;增殖与壮苗用诱导培养基和ER+ZT1mg·L-1+IAA1mg·L-1固体培养基交替进行,每1代增殖16倍以上;幼苗采用光、暗交替培养提高生长率120%以上;无根苗移植在泥炭土中成活率达94%以上.

低温胁迫对西洋杜鹃叶片叶绿素荧光参数的影响

低温伤害是限制西洋杜鹃产量和品质的主要因素之一,以其4个品种(系)‘五彩’、‘粉红’、‘梅红’、‘普红’的扦插苗为试验材料,分别在0、3、5、10℃中进行胁迫处理,研究不同低温下,西洋杜鹃叶绿素荧光动力学参数的变化。结果表明:低温胁迫下,西洋杜鹃幼苗叶片最大光能转换效率(F v/F m)显著下降、PSⅡ光下实际光化学效率(Yield)、光化学淬灭系数(qP)均同时下降;而非光化学猝灭系数(qN)则呈现上升趋势。从4个品种叶绿素荧光参数测定值看,‘普红’品种受害最严重,‘梅红’和‘五彩’次之,‘粉红’受冻害影响最小;西洋杜鹃幼苗对低温较敏感,低温伤害了光合机构,使其对光能的吸收、转换与光合电子传递均受到较显著的影响。

比利时杜鹃栽培品种(系)的ISSR分析

采用ISSR标记对11个比利时杜鹃(Rhododendron hybridum)栽培品种(系)的遗传多样性进行研究.采用13条引物共获得多态性位点106个.POP-GENE 32软件分析结果表明,11个品种(系)的有效等位基因数为1.5564个,Nei's基因多样性指数为0.3207,Shannon多样性指数为0.4742,多态性位点百分率为85.48%,总的遗传多样性水平较高.利用6个标记产生的8个多态位点绘制了11个栽培品种(系)计算机化的ISSR指纹图谱,结果表明,ISSR标记可用于区分比利时杜鹃品种.

西洋杜鹃组培苗生根培养及其内源激素含量变化的研究

对西洋杜鹃组培苗进行生根培养,并采用高效液相色谱法对培养过程中植物体内ZT、GA3、IAA、ABA 4种内源激素进行了测定,以及对比不同培养基组合对植物体生根效果及内源激素含量的影响。结果表明,各种内源激素共同作用调控植物体生根过程。期间IAA、ABA呈现先上升后下降的趋势,GA3、ZT呈现先下降后上升的趋势。IAA/GA3、IAA/ZT呈现先上升后下降的趋势,IAA/ABA则先下降后上升,而ABA/GA3则保持在一个相对稳定的水平。不同的培养基组合对植物体内源激素的调控起到了较大的作用。

不同氮源和pH值对比利时杜鹃叶片生理特征和营养元素的影响

为研究不同pH值和氮源对比利时杜鹃叶片生理特征和营养元素的影响,该文采用基质培养法,选取培养一致的3年生比利时杜鹃盆栽苗为试验材料,根据不同pH值（8.0和5.0）和不同氮源（NO3--N和NH4＋-N）将营养液分为4个处理,按完全随机区组设计,在北京卓越花卉温室培养,半年后对基质的理化性质和新鲜叶片中活性铁、活性锰、叶绿素含量、过氧化氢酶和过氧化物酶活性进行测定,并运用SPSS软件对测定结果进行分析。结果表明：pH值8.0的硝态氮处理的基质的pH值显著高于铵态氮处理;pH值5.0的硝态氮和铵态氮处理可使比利时杜鹃基质pH值保持在最适范围（5.5~4.5）;不同pH值和氮源处理对基质有效营养成分和比利时杜鹃外观没有明显差异。pH值5.0的铵态氮处理的叶片叶绿素和活性铁含量最高,其中新叶叶绿素平均含量为1.590 mg/g、新叶活性铁平均含量为26.379 mg/kg。新叶活性铁、活性锰和叶绿素平均含量均低于老叶;新叶的过氧化氢酶活性和老叶相当;新叶的过氧化物酶活性高于老叶。分析结果表明,在北方碱性水土地区,铵态氮源能提高比利时杜鹃叶片铁的有效性和叶绿素含量,增加过氧化氢酶的活性,防止失绿症的发生,比硝态氮源更有利于比利时杜鹃的生长。

水杨酸对低温胁迫下西洋杜鹃光合作用和叶绿素荧光的影响

为了解水杨酸(SA)提高西洋杜鹃幼苗抗寒性的生理机制,以抗寒性不同的2个西洋杜鹃品种(粉红、普红)为材料,研究叶面预先喷施不同浓度的SA(0,0.3,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol/L)对低温胁迫下西洋杜鹃幼苗气体交换参数、光化学效率的影响。结果表明SA预处理能够:1)缓解因低温胁迫导致的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、粉红品种胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)、PSII最大光化学效率(Fv/Fm)、PSII实际光化学量子产量(Yield)、光化学猝灭系数(QP)的下降;2)缓解低温导致的非光化学猝灭系数(NPQ),普红品种胞间CO2浓度(Ci)的上升;3)喷施0.5 mmol/L的SA能显著提高粉红品种的抗寒性,喷施1.5 mmol/L的SA能显著提高普红品种的抗寒性。

水杨酸对西洋杜鹃幼苗抗寒性的影响

为了解水杨酸(SA)对低温胁迫下西洋杜鹃幼苗生理指标的影响,以"粉红"品种为材料,用浓度分别为0.3、0.5、1.0、1.5、2.0mmol·L-1的水杨酸进行预处理,以喷施清水作为对照,研究0℃低温胁迫下处理4d西洋杜鹃幼苗生理指标的变化情况。结果表明,不同浓度的水杨酸预处理均能提高幼苗的抗寒性,尤以0.5mmol·L-1浓度的SA处理效果最佳。

比利时杜鹃研究进展

从生物学特性、繁殖、栽培、育种等方面归纳总结了近20年比利时杜鹃研究的 成果,并通过对相关文献的分析,就目前国内该领域研究的不足,及今后发展的主要方向与 重点进行了讨论。

GA_3对西洋杜鹃花期及生理生化指标的影响

以西洋杜鹃粉红品种为材料,研究了用不同浓度的GA_3处理对其花期及部分生理生化指标的影响,结果表明:不同浓度GA_3处理均能促进西洋杜鹃提前花期,延缓花瓣衰老,提高观赏品质。其中以1500 mg/L GA_3处理的效果最好,花期提前13 d,提高植物叶片与花瓣碳水化合物含量、花瓣SOD活性与花色素苷含量,降低花瓣MDA含量。

比利时杜鹃生物量调查

对比利时杜鹃的含水量及生物量进行了研究,结果显示叶的含水量最大,茎、根次之,但全株含水量变化不大,约占60%;根部的含水量及生物量变化最大;R/S比值逐年增大,但还是较小。此外,本文还采用相关分析及建立生物量一元线形回归、多元线性回归、非线性回归等回归方程,确定预测生物量的最佳回归模型。

西洋杜鹃ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以西洋杜鹃(Rhododendron hybridum)叶片提取的基因组DNA为材料,用引物UBC880(序列为GGA GAG GAG AGGAGA)研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对该种植物ISSR扩增结果的影响。确立了可用于西洋杜鹃ISSR-PCR分析的最适宜的PCR反应体系:20μL PCR反应体积中,含10 ng模板DNA,0.25 mmol.L-1 dNTPs,2.0 mmol.L-1 Mg2+,1.0U Taq DNA聚合酶,0.4μmol.L-1引物,并确定引物UBC 880的最适退火温度为54.4℃。PCR扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性45 s,54.4℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共40个循环后,72℃延伸7 min,4℃保存。应用该ISSR体系对11份西洋杜鹃种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。

西洋杜鹃SRAP体系优化及遗传多样性分析

以西洋杜鹃Rhododendron hybridum功能叶片为试验材料，采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取西洋杜鹃基因组DNA，并且运用L16（4^4）正交试验设计，在4个水平上对影响西洋杜鹃相关序列扩增多态性（SRAP）反应的锾离子（Mg^2＋）浓度、Taq酶用量、三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度、引物浓度等4个因素进行了优化，确立了一套适用于西洋杜鹃的稳定可靠、重复性强的SRAP-PCR反应体系。实验发现，其最佳反应体系（20．0μL）为：Mgn浓度1．750mmol·L^-1，dNTPs浓度0．175mmol．L^-1，砌酶1．500×16．67nkat，引物0．200μmol·L^-1。利用该优化体系对24个西洋杜鹃花品种进行遗传多样性分析。从88对SRAP引物中筛选出10对扩增清晰且多态性高的引物，共扩增出217条带，其中多态性条带212条，多态性比率达97.35％。24个杜鹃品种的遗传相似系数变化范围为0．591～0．708，算术平均数的非加权配对算术平均法（UPGMA）聚类分析结果显示：在相似系数为0．590处将24个供试品种分为2个类群，在相似系数为0．623处又可分为2个亚群，说明该优化体系可应用于西洋杜鹃花品种鉴定及遗传多样性的研究。

西洋杜鹃快繁增殖培养技术

对西洋杜鹃进行了组培,比较了不同外植体的诱导效果,通过正交试验对不同的组培配方进行了讨论,分析不同因子对杜鹃组培苗增殖效果的影响。结果表明,采用新生茎段,使用配方为改良Read+2.0mg·L-1ZT+0.5mg·L-1NAA的培养基培养效果最佳。