粘红酵母ATP:柠檬酸裂解酶基因的克隆表达和酶学性质

从粘红酵母(Rhodotorula glutinis)中克隆得到ATP:柠檬酸裂解酶基因两个亚基acl1和acl2,转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115进行诱导表达,通过Ni柱纯化目的蛋白,以实时波长扫描对重组蛋白的酶学性质进行测定。SDS-PAGE分析表明,两个亚基ACL1和ACL2的分子量分别为66 kDa和55 kDa。重组蛋白的酶学测定表明,经毕赤酵母表达后,单个亚基酶活性不到1.0 U.mg-1,双亚基混合后具有较高的酶活性,当混合质量比为1∶1时全酶的酶比活力达到最大,为6.5 U.mg-1,酶反应的最佳条件为:pH值8.5、37℃反应10 min。为提高油料作物油脂含量提供了新的转基因材料。

粘红酵母ATP-柠檬酸裂解酶提取方法研究

为建立一种高效的粘红酵母ATP-柠檬酸裂解酶粗酶提取方法,对比了酶法、研磨法、超声波法和玻璃珠法对粘红酵母胞内粗酶提取的影响,通过可溶性蛋白浓度分析和ATP-柠檬酸裂解酶活性测定,对粗酶提取方法进行评价,并在此基础上从震荡时间和珠体装量方面对玻璃珠法粘红酵母ATP-柠檬酸裂解酶提取工艺进行了优化。可溶性蛋白浓度分析和ATP-柠檬酸裂解酶活性测定结果表明:玻璃珠法提取粗酶优于其他3种方法。对玻璃珠法进行进一步优化,得到的最优化的提取条件为细胞干重与珠体重量之比为1∶1,冰浴震荡时间为20min,在此条件下,ATP-柠檬酸裂解酶比活可达到0.98U·mg^(-1),分别是酶法、研磨法、超声波法测得酶活性的1.9,2.2,2.1倍,可溶性蛋白浓度为6.5mg·m L^(-1),分别是酶法、研磨法、超声波法测得酶活性的1.4,4.1,3.3倍。经过优化的玻璃珠法提取粘红酵母胞内粗酶液操作简便,且能够保持较高的ATP-柠檬酸裂解酶活性,是较理想的粘红酵母粗酶提取方法。