基于3A组装的多拷贝基因策略优化重组水蛭素变体Ⅲ的生产

水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表达重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ,Rhv3)的办法。首先,在C.glutamicum中构建含Ptac启动子和CspA信号肽的Rhv3分泌表达菌株,比较其在不同培养基中的表达情况。结果表明在BHI培养基中Rhv3活性最高,达到3.02×10^(3) ATU/L。为进一步提升Rhv3产量,通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)筛选,选用RBS1应用于Rhv3多拷贝菌株构建和表达。然后利用3A组装技术构建含不同信号肽和不同拷贝数的Rhv3分泌表达菌株进一步优化其产量。通过放大发酵培养,Rhv3产量达到1.89 g/L,活性达到10.91×10^(3) ATU/L。最后利用镍柱对Rhv3进行简单纯化,其纯度达到90%。该异源表达策略有效提高Rhv3表达量,为Rhv3的重组生产提供了一种质量可靠、低成本的表达体系。

抗体夹心酶免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3研究

将重组E. coli水蛭素HV3和BSA交联后免疫豚鼠和家兔,DEAE-纤维素柱层析纯化IgG.用这两种抗体和酶标二抗羊抗兔IgG-HRP建立三抗体夹心酶联免疫吸附法,测定重组E. coli水蛭素HV3的含量.本测定方法的线性范围为0～2 ng/ml,灵敏度为0.04 ng/ml.建立的三抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3具有良好的精密度、回收率、灵敏度和特异性.

重组水蛭素RHV3间接竞争ELISA方法的建立

BSA为载体偶联重组水蛭素RHV3,制备的完全抗原免疫新西兰兔,获得了高效价多克隆抗体,间接竞争ELISA方法学测定RHV3的含量。本方法的线性范围为10~1280ng/ml,灵敏度为1.15ng/ml,且具有良好的灵敏度,精密度与回收率。

乳酸菌表达的重组水蛭素的壳聚糖微粒的口服药效学研究

通过测定小鼠的出血时间(BT)和活化部分凝血活酶时间(APTT),验证乳酸菌表达的重组水蛭素Ⅲ壳聚糖微粒的口服药效学。重组水蛭素样品是由乳酸菌在摇瓶水平30℃静置培养表达的。它的表达是由乳链菌肽诱导的,且表达的蛋白的量受其调控。水蛭素只经过阴离子交换树脂纯化浓缩。最后浓缩的水蛭素样品制成壳聚糖-TPP微粒。30只小鼠,雌雄各半,被随机分为3组:对照组(生理盐水),水蛭素组(500 ATU/kg),阿司匹林组(20 mg/kg)。给小鼠灌胃给药后,以剪尾法测定小鼠出血时间,以小鼠毛细管眼眶取血法测定活化部分凝血活酶时间。结果显示给药组与对照组的BT值和APTT值均有显著差异。乳酸菌NICE表达系统分泌表达的重组水蛭素,以壳聚糖-TPP微粒口服制剂口服给药后,证实其口服有效。