改造枯草芽孢杆菌底盘细胞高效生产乙偶姻

以实验室前期保藏的经代谢工程改造的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QRC-1为出发菌株,其在5 L发酵罐平均发酵生产乙偶姻的产量达到50.7 g/L。然而,枯草芽孢杆菌存在的自溶与生长速率较慢的问题限制了其在发酵过程中的生物量增长,同时发酵产泡多的特点也影响了该菌在放大培养过程中的实时调控。因此本实验基于生理特性对枯草芽孢杆菌QRC-1进行优化改造,利用分子遗传技术开发一种新的策略,达到提高生物量和乙偶姻产量的目标。最终获得的菌株RKCR-8,比生长速率比原菌提高了30%,生物量增加了1.36倍,乙偶姻产量达到72.3 g/L。使用本研究构建的重组枯草芽孢杆菌生产乙偶姻具有更强的生产效率和工业稳定性。这一结果不仅为乙偶姻的生产提供更多参考价值,也为未来工业微生物底盘的构建提供了一种新的思路。

枯草芽孢杆菌发酵工艺研究进展

综述了枯草芽孢杆菌发酵过程中涉及的多种发酵工程策略,详细探讨了包括高产菌株的选育、培养基的优化、发酵条件的设定以及发酵过程的精细调控等方面的内容。探讨了通过传统育种技术和现代基因工程手段来提高菌株产量的方法。分析了不同营养成分和添加剂对菌株生长和产物生成的影响。介绍了温度、pH、溶氧量等因素对发酵过程的影响及其优化策略。此外,还探讨了发酵过程的动态监控和调控方法,以实现高效的生产过程。对枯草芽孢杆菌工程菌发酵领域的最新研究现状进行了全面介绍,总结了当前的研究成果和存在的问题,提出了未来研究的方向和可能的发展趋势。

有机氯农药对土壤生态污染的影响及生物强化修复研究

有机氯农药性质稳定,虽已禁用数十年,但在土壤中仍然存在一定的污染残留。为了改善有机氯农药对土壤的生态污染情况,研究有机氯农药对土壤生态污染的影响及生物强化修复方法。选取农药厂旧址作为研究地点,分析生物强化修复技术对土壤生态污染的作用。选取枯草芽孢杆菌作为生态强化修复技术的菌种,采用基因工程菌种方式,降解土壤中有机氯农药。研究结果表明,生物强化修复技术对土壤中的六氯环己烷、DDD、DDE等有机氯农药降解效果明显,受污染土壤中,六氯环己烷和DDT的去除率均高于96%,具有修复有机氯农药土壤生态污染的作用。

核黄素基因工程研究进展

核黄素 (维生素B2 )为天然水溶性的B族维生素 ,是维持机体正常代谢所必须的物质 ,具有重要的生理功能。目前核黄素的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法是后来发展起来的一种十分经济有效的方法 ,并在核黄素主产中开始占据主导地位。为进一步获得核黄素高产菌株 ,人们对核黄素合成基因及其表达调控的机制做了深入细致的研究 ,并以此为依据 ,通过基因工程手段构建出了核黄素高产菌株 ,大大提高了核黄素的产量 ,其中尤以枯草芽孢杆菌最为成功。综述发酵法生产核黄素的现状、核黄素生物合成的分子生物学以及基因工程研究进展 ,讨论了其进一步的发展方向。

绿色荧光蛋白基因标记野生型生防枯草芽孢杆菌的研究

根据绿色荧光蛋白基因和枯草芽孢杆菌木糖诱导型启动子PxylR序列 ,分别设计两对特异引物primersPxyF R和primersgfpF R ,扩增获得了完整的启动子PxylR和gfp基因序列。进一步以上述产物混合物为模板 ,以primerPxyF primergfpR做引物进行重迭PCR ,获得了PxylR gfp重组翻译融合表达盒。经SphⅠ和KpnⅠ完全酶切后 ,将PxylR gfp表达盒分别插入大肠杆菌_苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315和大肠杆菌 枯草芽孢杆菌穿梭载体pRP2 2。相应的重组表达质粒pGFP315和pGFP2 2转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。前者在标准菌株 16 8中得到良好发光表型 ,后者则在标准菌株 16 8和野生目标菌株B916中均得到良好的发光表型。室内平板抑菌实验结果显示B916生防效果与出发菌株没有明显差异 ,遗传稳定性研究表明连续稀释培养约 175代后 ,工程菌株稳定性为 94 % ,质粒丢失频率低于 3 5× 10 - 4 代。

枯草芽孢杆菌工程菌株产普鲁兰酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产长野芽孢杆菌普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB600/pWB-pulB,通过单因素筛选及正交试验进行发酵培养基优化,得到产酶最佳配方为玉米淀粉3.0%,酵母膏2.0%,CaCl20.03%,Na2HPO41.0%。同时对重组菌株摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了产酶最佳培养条件为,以3%接种量接种于优化后培养基,初始pH7.0,装液量30 mL/250 mL,37℃,200 r/min摇床培养36 h。在此优化条件下,普鲁兰酶活力达到20.16 U/mL,是之前研究结果(10.94 U/mL)的1.84倍。

食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展

综述了枯草芽孢杆菌表达系统的特点、载体及其元件、转化方法及外源基因表达和蛋白分泌机理等方面的基础研究和最新进展。

枯草芽孢杆菌工程菌产中温α-淀粉酶发酵条件优化

利用基因工程的手段获得高产中温α-淀粉酶基因工程菌株pWB—amy／WB600，对其在7L发酵罐中的发酵条件进行了研究和优化。结果表明，发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速来控制发酵液中的溶氧含量，使溶氧浓度控制为15％-25％；采用流加氨水的方式控制发酵液的pH值为6．0～7．5；并且利用间歇补料的方式，有利于酶量的积累，优化过后的发酵液酶活比未优化时提高了41％。

枯草芽孢杆菌工程菌发酵技术的研究进展

枯草芽孢杆菌既是有益菌,又是表达外源蛋白的工具,其产生的工程菌的许多特性随着其所携带的基因发生一定变化。工程菌生物发酵的目的是扩大携带外源基因的菌体分泌蛋白量和菌体自身的产量。文章主要介绍枯草芽孢杆菌的表达系统,分析发酵条件控制和补料策略对基因工程菌体生产量的影响,并对枯草芽孢杆菌工程菌发酵领域的研究现状进行综述。

表达hrpZ_(Psg12)基因的重组枯草芽孢杆菌工程菌株构建及其生防活性评价

【目的】提高生防枯草芽孢杆菌JN209的稳定性及生防活性。【方法】利用基因工程技术,构建含hrpZPsg12基因的分泌表达载体,采用电转化方法将从大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因转化至枯草芽孢杆菌JN209中,同时采用抑菌圈法测定宿主菌与基因工程菌抑菌活性的变化,评价其作为生物农药在田间对烟草病毒病的生防效果。【结果】成功构建了重组枯草芽孢杆菌基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12。抑菌活性分析表明,基因工程菌株在保持原始宿主菌株抑菌活性的同时,对部分靶标菌的抑菌效果有明显提高。烟草病毒病田间小区防治试验表明:与原始宿主菌JN209相比,新构建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12对烟草病毒病的防效有明显提高。【结论】改良的基因工程菌在抑菌谱和抑菌活性方面均有明显提高,同时对烟草病毒病也有较好的防治效果,可进一步开发为新型生物农药。

外源添加物对枯草芽孢杆菌产核黄素的影响

在代谢网络分析和发酵特性研究的基础上,以菌体浓度和核黄素产量为指标,考察了7种外源添加物对枯草芽孢杆菌发酵产核黄素的影响。结果表明,添加葡萄糖酸钙、柠檬酸钠和丙氨酸对核黄素发酵有明显的促进作用,针对这3种添加物,进一步研究了其添加时间和添加量对核黄素发酵的影响,确定三者的最适添加时间分别为0、0、18 h,最适添加量分别为7.5、4、2 g/L。最后通过正交实验确定组合添加3种促进剂的最佳浓度配比为7.5、5、1.5 g/L;在最佳组合添加条件下,核黄素产量高达6.46 g/L,比单独添加时提高了约8%,比未添加时提高了40%左右。

枯草芽孢杆菌工程菌产耐酸性高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产耐酸性高温α-淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌株pWB-amyd/WB600,通过单因素筛选及正交实验进行发酵培养基优化,得到的最佳配方为(g/L):玉米粉20,蛋白胨30,CaCl20.5,Na2HPO48.同时对实验室摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了最佳培养条件:37,℃、pH 6.5、200,r/min摇床培养36,h,接种量为2%,装液量为30,mL/250,mL.在此优化条件下,耐酸性高温α-淀粉酶活力达到3,980,U/mL,是未优化条件下的2.1倍.

核黄素基因工程菌的构建及其发酵的初步研究

构建整合型核黄素质粒pRB63,该质粒含有解调的B.subtilis核黄素操纵子,将其转化入B.subtilis RH13并在染色体上进行适当的扩增后得到RH13::[pRB63]n系列工程菌,其核黄素合成能力随着pRB63扩增程度的增加而增强,最终达到RH13的6～7倍。随后以RH13::[pRB63]n系列工程菌和B.subtilis YB1为亲株进行原生质体融合,筛得重组菌B.subtilis RH33。该菌在含10%葡萄糖或蔗糖的分批发酵中培养64h可产核黄素量4.2g·L-1。采用以葡萄糖为碳源的流加发酵工艺,24h可积累核黄素7～8g·L-1,48h达11～12g·L-1,核黄素对葡萄糖的得率为0.056g·g-1。

嵌合信号肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

为提高α-淀粉酶的分泌效率,将不同天然信号肽的N,H和C区进行组合,以期筛选出优于天然信号肽的嵌合信号肽。首先从天然信号肽库中筛选了适合解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分泌的天然信号肽,以其中4种天然信号肽(SPyvcE,SPyoqM,SPBglS和SPyobB)的H区替换信号肽SPsacB的H区,构建4种嵌合信号肽RSP1—RSP4指导α-淀粉酶的基因工程菌株。结果表明,适合α-淀粉酶的最适天然信号肽和嵌合信号肽分别为SPyoqM和RSP1,且RSP1指导α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌的分泌效率较SPyoqM提高27%,较具有相同H区的SPyvcE提高了3.6倍,较仅H区不同的SPsacB提高了2.07倍。嵌合信号肽构建策略是一种有效提高α-淀粉酶分泌效率的方法,可为其他蛋白质的高效分泌提供参考。

桑天牛肠道微生物内切葡聚糖酶基因的克隆及在乳酸杆菌中的表达

本试验旨在构建含内切葡聚糖酶基因的重组乳酸杆菌,研究其对秸秆植物性饲料的降解效果,为后期构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。从桑天牛(Apriona germari)体内分离出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),克隆其内切葡聚糖酶基因,通过酶切连接的方式将目的基因片段与启动子P 32、信号肽SP lp0373、乳酸杆菌载体pLEM-415共同构建了内切葡聚糖酶分泌表达重组质粒pLEM-P 32 SP Nqm,并对重组乳酸菌酶学性质和其在秸秆饲料中的降解能力进行测定。结果表明:从枯草芽孢杆菌中克隆出的目的基因大小为1490 bp,构建的重组乳酸杆菌其表达产物的蛋白大小约54 ku。进一步测定发现,重组乳酸杆菌产酶最适温度和时间分别为37℃、24 h,在最佳条件下其羧甲基纤维素酶(CMCase)活性为2.06 U/mL。酶促反应最适温度和pH分别为60℃、6.0。在50~70℃、弱酸性条件下该酶的稳定性较好。金属离子Na^+、K^+、Mn^2+对酶促反应有促进作用,而Mg^2+、Cu^2+对酶活性抑制作用较大。重组乳酸杆菌发酵粗饲料,对玉米秸秆、苜蓿秸秆、小麦秸秆均发挥了一定的降解作用,中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维相对降解率分别为10.42%、21.12%,4.99%、7.85%,4.57%、9.53%。综上,本试验构建的重组乳酸杆菌对常见的秸秆植物性饲料均有一定的降解能力。

核黄素制备研究进展

核黄素是人类必需的水溶性维生素,是机体中许多酶系统的重要辅基的组成部分,参与着物质和能量代谢。近年来,如何低成本地大量制备高纯度的核黄素已经成为科学研究的主要内容。综述核黄素的制备方法,如:微生物发酵制备法,基因工程制备法,生物提取法,还有较常见的化学制备法,并对核黄素的发展做了展望。

枯草芽孢杆菌产酶活性改良研究进展

本文对各种提高枯草芽孢杆菌产酶活性的措施进行了综述,对每种方法的优缺点进行了比较,并对改良技术的发展进行了展望。

抗植物软腐病枯草芽孢杆菌的高密度发酵优化

为提高菌体产量,以益生菌枯草芽孢杆菌Asr作为发酵菌株,采用正交试验法和响应面法,对枯草芽孢杆菌Asr的发酵工艺进行了优化研究。结果表明,影响菌体产量最主要的3个因素为酵母浸粉、MgSO4和CaCl 2;最佳发酵培养基配方为蔗糖20 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸粉8.65 g/L,K 2HPO 43.0 g/L,MgSO 40.27 g/L,CaCl 20.53 g/L;最佳培养条件为温度37℃、初始pH值7.0、接种量10%、搅拌转速250 r/min;应用优化配方及工艺,枯草芽孢杆菌Asr的最高产量达到7.30×10^8 cfu/mL,菌体产量较优化前提高了3.95倍。研究结果可为后续菌体发酵罐的扩大培养提供技术支撑,对其他枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化研究提供借鉴。

高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化

以产纳豆激酶的地衣芽孢杆菌基因工程菌BL10(pP43SNT-SsacC)为出发菌株,开展其全合成培养基的发酵优化研究。通过单因素试验和正交试验优化了全合成培养基成分,获得了最优的培养基组成(g/L):葡萄糖30、NaNO_330、谷氨酸钠20、柠檬酸钠15、MgSO_4·7H_2O0.5、K_2HPO_4·3H_2O1.5、CaCl_20.5,pH7.2。在优化的全合成培养基中,纳豆激酶最高酶活力达到25.59FU/mL,相比于初始培养基发酵活性(4.27FU/mL),提高了5倍。对比分析了全合成培养基和半合成培养基的发酵产物,结果表明,全合成培养基可显著提高纳豆激酶的纯度,与半合成培养基相比,纳豆激酶比活力提高了2倍。本研究获得了纳豆激酶的全合成培养基成分,显著提高了纳豆激酶发酵活性,并进一步提高了纳豆激酶发酵纯度。

海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建

通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌,并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和稳定性分析。结果表明,海参溶菌酶基因特异引物在400 bp处扩增出特异性条带,与预期的海参溶菌酶基因大小一致;重组表达质粒pHT43-SjLys经双酶切验证得8 000 bp和400 bp左右的片段;重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌与原始菌株WB600相比生长趋势基本一致,外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响;在无选择压力的条件下,重组质粒的稳定性良好,连续传5次后的遗传稳定性为94%,并且提取质粒和双酶切验证后发现工程菌没有发现重排或丢失现象。表明重组海参溶菌酶基因工程菌pHT43-SjLys/WB600构建成功。