水稻矮缩病毒(RDV)基因组cDNA克隆和部分DNA序列分析

采用氯仿处理、聚乙二醇沉淀和蔗糖密度梯度离心的方法,从感病的水稻叶片中分离、纯化了水稻矮缩病毒(RDV)。在琼脂糖凝胶板上电泳分离到了9个 RNA 片段的 RDV 基因组。用电泳回收的方法纯化了 RDV 基因组的各 RNA 片段。利用 ollgo dT 作为引物,合成并克隆了其中几个片段的 cDNA。通过对 cDNA 克隆的物理图谱分析,建立了亚克隆,测定了它们的 cDNA 序列。这里报告其中第8条片段的 cDNA 部分序列。

水稻矮缩病毒昆明分离物抗血清制备及免疫捕捉PCR检测

By Using the modified method to extract Rice dwarf virus virions from infected rice leaves,a concentration 3.854mg/mL of purified virus virions reached,and the Rabbits was immunized with purified virions,yielding high titer antiserum;1:20480 by the indirect enzyme-linked immunosorbent assay(I-ELISA)test.The antiserum successfully detected three rice samples from Kunming,Yuxi and Luliang by I-ELISA.Immunocapture polymerase chain reaction(IC-PCR),respectively was the utilized to show that serologic and molecular methods were successfully used for detection of Rice dwarf virus.

水稻矮缩病毒第一号组份基因和编码蛋白的序列分析

水稻矮缩病毒（RiceDwarfVirus，简称RDV）是我国南方水稻病毒病的重要病原，属植物呼肠孤病毒。从中国福建分离物中克隆了基因组第一号片段（S1）的全长cDNA并对其进行全序列分析，结果表明RDV福建分离物S1克隆片段全长4422bp，含有一个长4332bp的开放阅读框架，编码一个由1444个氨基酸组成的多肽（P1），分子量为164kD．根据基因序列，对推测的P1氨基酸序列分析表明，序列中含有依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependentpolymerase-RDRP）保守序列：motifＩ（DXXXXD）、motifⅡ（SGXXXTXXXN）和motifⅢ（GDD），除此之外，在模式Ⅲ后还存在一个很保守的区域EXXKXY。由此说明RDVS1编码的蛋白P1可能是病毒的一种RDRP。将RDV福建分离物引核苷酸和编码蛋白氨基酸序列与日本流行株系相比，同源性分别为95％和97％。RDV福建分离物S1序列已被DenBank接受，号码为U73201。

表达反义核酶RNA的转基因水稻对矮缩病毒复制和症状的抑制作用

用基因枪法将含有ＲＤＶ第五片段反义核酶序列基因的植物表达载体ｐＲＯＫＩＩ转化水稻幼胚，在Ｇ４１８存在的条件下，约２～３个月可筛选出抗性愈伤，转入分化培养基中培养可分化出幼苗。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法检测为阳性的水稻幼苗进行抗病性测定显示，转ＲＤＶ反义核酶基因的水稻植株对ＲＤＶ的复制和症状有显著抑制作用。转基因植株发病较轻，并能部分结实，而对照植株则明显矮化且大多不能抽穗。

16个水稻品种对水稻矮缩病毒抗性的鉴定

16个水稻品种对水稻矮缩病毒(Rice dwarfvirus,RDV)的抗性鉴定结果表明:不同水稻品种对RDV的抗性存在明显差异.根据各品种的发病率划分其抗性等级.免疫品种1个,占供试品种的6.25%;中抗品种6个,占37.50%;中感品种3个,占18.75%;高感品种6个,占37.50%.感病品种潜育期较短,为11-15 d左右;抗病品种潜育期较长,为15-20 d左右.水稻品种的发病率与叶蝉带毒率密切相关,相关系数为99.99%.协优46兼具抗虫性和抗病性;宜香2292仅具抗病性;冈优734为免疫品种,是水稻矮缩病抗性育种的良好材料.

用含水冷冻电镜技术测定的水稻矮缩病毒的三维结构

用含水冷冻电镜技术和计算机数据处理方法分别测定了水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）完整颗粒和只含内壳层的颗粒的三维结构，其分辨率分别为２．６ｎｍ和３．３ｎｍ。从完整颗粒的结构中可以清晰地看到它的外壳层和内壳层的双层结构及其内部的ＲＮＡ或非结构蛋白质的电子密度。完整颗粒和内壳层的直径分别为６９．８ｎｍ和５４．０ｎｍ，外壳层和内壳层的厚度分别为６．９ｎｍ和２．５ｎｍ。外壳层表面的三角形剖分数Ｔ＝１３。外壳层由２６０个衣粒（三体）组成，因此共有７８０个蛋白质亚基。外壳层和内壳层上均有许多通道。内外壳层之间以及外壳层的衣粒之间是以一种十分新颖的联锁方式相互连接的。

抗水稻矮缩病毒的反义核酶及复制酶部分序列的合成、克隆及其水稻表达载体的构建

采用反转录－聚合酶链式反应方法（ＲＴＰ－ＣＲ），在人工合成的引物引导下，扩增出水稻矮缩病毒基因组第一片段（Ｓ１）全长序列及第五片段的部分序列（ＳＳⅢ）．将扩增的片段分别克隆到克隆载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）及ｐＵＣ１９的ｓｍａｌ位点上，并进行了序列测定。在此基础上，利用ｐＣＲ引入的方法将核酶序列引入到Ｓ５Ⅲ片段反义链上以构成反义核酶基因Ｓ５ⅢＲ，将Ｓ１片段５＇端部分序列（Ｓ１－１）及Ｓ５ⅢＲ基因克隆到植物表达载体ｐＲＯＫⅡ上，构建成水稻转化载体ｐＲＯＫ－Ｓ１－１＇及ｐＲＯＫ－Ｓ５ⅢＲ。

黑尾叶蝉NcPGRP基因克隆及表达模式分析

为明确黑尾叶蝉肽聚糖识别蛋白(Nephotettix cincticeps peptidoglycan recognition protein,Nc PGRP)的功能,利用RT-PCR克隆长度为552 bp的Nc PGRP开放阅读框,其编码蛋白大小为19.9 k D,无信号肽,含3个锌离子结合/酰胺酶催化位点,1个二氨基庚二酸型(Dap型)肽聚糖识别位点。系统发育分析表明,Nc PGRP与其他昆虫亲缘关系较远。利用显微注射技术对黑尾叶蝉进行病原细菌诱导,定量PCR结果显示Nc PGRP在受大肠杆菌及藤黄微球菌刺激后,其转录水平显著上调。组织分布研究表明,Nc PGRP的m RNA在各组织中均有表达,且头部表达量最高。黑尾叶蝉取食感染水稻普通矮缩病毒RDV的水稻后,Nc PGRP转录水平受抑制。本文研究表明,Nc PGRP是一种诱导型表达的PGRP,黑尾叶蝉感染RDV能显著抑制其转录,进而削弱黑尾叶蝉免疫能力,这可能有利于RDV与黑尾叶蝉共生。

黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体制备及应用

【目的】制备效价高且特异性强的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白Argonaute 2(AGO2)多克隆抗体,为进一步研究AGO2蛋白在叶蝉RNAi免疫途径中的调控功能及作用机制提供技术支持。【方法】通过RT-PCR从黑尾叶蝉基因组扩增出AGO2基因的功能片段,与原核表达质粒pET-28a重组构建重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达;以纯化的AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体,并以多克隆抗体为一抗,采用Western blotting检测AGO2蛋白在健康和带毒黑尾叶蝉中的表达情况。【结果】RT-PCR扩增获得的黑尾叶蝉AGO2基因片段为1635 bp,构建的pET-AGO2重组质粒能在BL21感受态细胞中成功表达出AGO2融合蛋白,其最适表达条件:温度28℃,IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间5 h,摇床转速220 r/min。以纯化AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得的多克隆抗体效价为1∶106,抗体浓度约350μg/mL。Western blotting检测结果表明,AGO2蛋白在健康和水稻矮缩病毒(RDV)感染黑尾叶蝉中均有表达,但与健康黑尾叶蝉相比,AGO2蛋白在RDV感染黑尾叶蝉中的表达水平更高,即RDV侵染能提高AGO2蛋白的表达水平。【结论】制备获得的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体具有高纯度和高效价,且特异性强,可用于检测AGO2蛋白在病毒感染黑尾叶蝉中的表达水平,进而揭示AGO2蛋白在介体昆虫RNAi途径中的功能机制。

转水稻粗缩病毒运动蛋白缺陷型基因玉米的二重PCR检测

以外源基因(RDV MP-)和玉米内源基因Zein作为PCR扩增对象,旨在建立一种简便有效的转基因玉米及其产品的二重PCR检测技术。转外源基因(RDV MP-)材料的常规PCR检测结果证明外源基因在转基因材料中可稳定遗传;对常规PCR检测的阴性结果材料进行二重PCR检测,扩增结果除进一步证实常规PCR检测的阴性结果结论外,还证明提取的植物总DNA质量符合试验要求,进而从二重PCR检测结果还得出常规PCR检测的阴性结果出错率为1.4%。此方法简单,实用,结果可靠,可适用于转基因植物及产品的检测。

水稻普通矮缩病研究进展

水稻普通矮缩病(又称普矮病),是由叶蝉传播的一类病毒性病害,近年来有扩散的趋势。该病在水稻上的发病症状表现为感病植株矮小、无效分蘖增多、根系发育不良、叶片僵直、不能抽穗,造成水稻减产和绝收,给粮食生产安全带来巨大威胁。主要就病原及其介体、病毒检测方法、基因工程及RNA干扰技术培育抗病性种质及品种筛选等方面对近年来水稻普通矮缩病相关研究进展进行阐述,为该病的深入研究特别是基因工程育种提供参考。