普氏立克次体120kDa表面抗原N段基因的克隆与表达

目的 克隆和表达普氏立克次体 (Rickettsiaprowazekii) 12 0kDa外膜蛋白N段基因。 方法 采用PCR方法 ,从普氏立克次体基因组中扩增其 12 0kDa表面抗原N段基因片段 ,将其与原核表达载体 pQE30连接 ,构建重组质粒 pQE30 /2 6kDa,将重组质粒转入大肠杆菌 ,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达。结果 获得长为 717bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知普氏立克次体 12 0kDa表面抗原基因一致 ;SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 2 6 .3kDa处有一表达带 ;免疫印迹分析证明它能与普氏立克次体免疫兔血清反应 ;经双波长薄层扫描分析 ,目的蛋白占全菌体蛋白的 2 0 % ;提取表达菌体包涵体检查 ,证明目的蛋白主要存在于包涵体中。结论 普氏立克次体 12 0kDa表面抗原N段基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,该重组蛋白具有良好的免疫反应性。

普氏立克次体120kDa表面抗原C段基因的克隆与表达

采用PCR方法 ,从普氏立克次体基因组中扩增出 1 2 0kDa表面抗原C段基因片断 ,并将其克隆于原核表达载体pQE30 ,构建重组质粒pQE30 6 7,将重组质粒转入大肠杆菌M1 5 ,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达。SDS PAGE分析发现重组质粒转化菌产生了一 6 7kDa重组蛋白 ;在免疫印迹分析中 ,该 6 7kDa重组蛋白与普氏立克次体免疫血清发生特异反应 ,显示 6 7kDa重组蛋白具有普氏立克次体 1 2

用种特异性聚合酶链反应检测普氏立克次体的研究

目的 建立特异敏感的快速检验普氏立克次体PCR检测方法 ,并能与莫氏立克次体相区分。方法 采用种特异性巢式PCR方法 ,进行实验室模拟检测。结果 以普氏立克次体的rpa14 /16基因为靶标设计了两对引物 ;该引物特异性实验表明仅普氏立克次体特异性片段可以扩增出来 ,其余相关立克次体均扩增不出 ,尤其可鉴别其同群的莫氏立克次体 ;敏感性测试结果可检测出 6 3fg的普氏立克次体DNA ,可检测出 0 0 5个鸡胚半数感染量 (CEID5 0 )的立克次体 ;对人工模拟的小鼠脏器研磨液、血液标本检测发现该法在血液标本中的检测敏感性下降 3～ 4个滴度。结论 我们建立的巢式PCR可快速检验普氏立克次体 。

普氏立克次体120kDa表面蛋白N端和C端重组蛋白的抗原特异性研究

用免疫印迹和酶联免疫吸附试验分析普氏立克次体N端和C端重组蛋白,发现2个重组蛋白除与普氏立克次体免疫血清发生特异性反应外,并与立氏立克次体免疫血清发生反应,这2种立克次体也被这2个重组蛋白免疫血清所识别,提示这2个重组蛋白含有普氏和立氏立克次体的共同抗原决定簇。

基因克隆技术在普氏立克次体研究中的应用

我们用鸟枪法，将普氏立克次体ＤＮＡ经酶切，连接，用ｐＵＣ１９为载体，大肠杆菌ＪＭ１０３为受体菌，将酶切后的连接产物转化到大肠杆菌ＪＭ１０３中去，用酶联法、改良补体结合法筛选克隆子。这样得到２株酶联效价为１∶１２８０的阳性克隆子，它们与普氏立克次体免疫血清呈阳性反应。

普氏立克次体重组表面蛋白制备和免疫印迹抗原特异性分析

目的克隆与表达普氏立克次体(Rickettesia prowazekii)主要蛋白抗原基因,分析所表达重组蛋白的抗原特异性。方法采用PCR法从普氏立克次体全基因组中扩增其主要抗原基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒;将基因重组表达质粒转化大肠杆菌,用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白。将普氏立克次体、莫氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、贝氏柯克斯体等实验感染小鼠血清与重组蛋白做免疫印迹。结果经过PCR扩增后获得9个目的基因片段,用其构建出9个原核表达质粒;9个原核表达质粒转化菌均高效表达出相应的重组蛋白;结果显示FtsZ、GroEL、Rp828、EF-Ts等4个蛋白特异性最好,仅与普氏立克次体感染小鼠血清反应;其次是Omp,它除与普氏立克次体感染小鼠血清反应外,仅与莫氏立克次体感染血清反应。结论 FtsZ等4个重组蛋白为普氏立克次体的特异性抗原,可以作为研制流行性斑疹伤寒血清学诊断试剂的候选抗原。

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因(ompB)序列设计引物和探针,以克隆的OmpB基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0．999)；与巢式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA,检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本,某些样本检测为阳性,而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA,可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。

酿酒酵母线粒体蛋白转运系统在立克次体中的同源分析

进化分析表明,与线粒体亲缘关系最近的原核生物是立克次体(Rickettsia prowazekii).搜索酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)线粒体蛋白转运系统的35个亚基在立克次体中的同源蛋白质,仅发现了5个同源蛋白,且它们只属于转运系统在线粒体外膜和基质上的模块,没有发现转运系统在膜间隙和内膜模块的同源蛋白.对大肠杆菌(Escherichiacoli K-12 MG1655)的分析也有类似的结果.因此线粒体蛋白转运系统应该不是直接起源于内共生的原核生物.

用16S rRNA探针定量测定普氏立克次体在细胞内的繁殖量

目的以普氏立克次体为研究对象，建立一种定量测定胞内微生物繁殖的方法。方法从立克次体感染细胞提取总ＲＮＡ为样品或用硫氰酸胍裂解感染细胞，以裂解物为样品，用３２Ｐ标记的１６ＳｒＲＮＡ特异探针做ＲＮＡ酶保护分析。根据探针分子结合数，计算出检测到的靶序列分子数，反映胞内微生物的繁殖量。结果从０．５μｌ直接裂解物可检测到３．９４×１０４个１６ＳｒＲＮＡ分子；从６ｐｇ的总ＲＮＡ中可检测到５．８２×１０４个１６ＳｒＲＮＡ分子。用本法试测立克次体在宿主细胞内的生长曲线，只表现出迟缓期及对数生长期，而无稳定期及衰退期。结论用特异性探针通过ＲＮＡ酶保护分析法可以定量测定胞内微生物在宿主细胞内的繁殖量。

普氏立克次体120×10~3表面抗原的N端和C端重组蛋白免疫原性的研究

目的:评价普氏立克次体120×103表面抗原的N端和C端重组蛋白的免疫原性。方法:将纯化的N端和C端重组蛋白分别免疫小鼠,采用酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验分析免疫小鼠的体液免疫应答水平;用MTT法评价小鼠脾淋巴细胞的增殖情况,分析免疫小鼠的细胞免疫应答水平,并采用RT-PCR方法检测免疫小鼠脾淋巴细胞被重组蛋白刺激后细胞因子的表达。结果:N端和C端重组蛋白均诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,诱导高水平的小鼠脾淋巴细胞增殖;经两种重组蛋白刺激的小鼠脾淋巴细胞均表达了IFN-γ和IL-2。结论:普氏立克次体120×103表面抗原的N端和C端重组蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,可作为流行性斑疹伤寒亚单位疫苗的候选蛋白。