用PCR技术扩增恙虫病立克次体Sta58主要抗原基因的部分片段

参照国外发表的恙虫病立克次体Karp株sta58全基因序列,合成1对DNA引物(27个碱基和23个碱基),以Karp DNA为模板,成功扩增了长约Ikb的DNA片段。将PCR技术应用于立克次体研究,为今后用PCR检测立克次体以及立克次体分子克隆研究起了探索作用。

恙虫病立克次体Karp株Sta56部分基因片段的扩增、克隆及鉴定

目的为了进一步完善恙虫病立克次体的株型鉴定技术，并且为临床提供诊断试剂。方法本文采用ＮＰＣＲ技术，参考并自行设计两对寡核苷酸引物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４），从恙虫病立克次体Ｋａｒｐ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出编码Ｓｔａ５６抗原的部分基因片段，经纯化后用ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后，克隆到质粒ＰＵＣ１８中，转化大肠杆菌ＴＧ１，经ＰＣＲ和双酶切鉴定。结果与结论构建了重组质粒ＰＵＣ１８－ＲＫ，从而为该基因片段的表达奠定了基础。

Cloning and expression and purification of Hepatitis B e-antigen precursor in Escherichia coli

OBJECTIVE: To investigate the role of the 25 kD hepatitis B e antigen (HBeAg) precursor that only exist inside hepatocytes and study its effect on the pathopoiesis of hepatitis B and QIAGEN expression and purification system. METHODS: Hepatitis B virus (HBV) preC/C gene for the 25 kD HBeAg precursor was cloned into the expression vector pQE30 and the 25 kD HBeAg precursor was expressed in Escherichia coli (E. coli) and purified. Its antigenicity for 21 kD mature HBeAg was tested by western blot analysis. RESULTS: Cloned fragments in the expression vector were sequenced and verified to be homogeneous with that of HBV (ayw subtype). Expression of the HBeAg precursor in E. coli under the transcriptional regulation of T5 promoter yielded a soluble cytosolic protein with an apparent molecular mass of 25 kD. Recombinant HBeAg precursor exhibited identical potencies with 21 kD mature HBeAg that reacted with anti-HBeAg antibodies. The purification rate of the expressed HBeAg precursor was up to 89.6% and the yield of purified HBeAg precursor from this procedure was 2.4 mg/L. CONCLUSION: 25 kD HBeAg precursor exhibited biological activity and might play an important role in pathopoiesis of hepatitis B.

幽门螺杆菌CagA蛋白肽段的基因克隆、表达及抗原性检测

目的 克隆幽门螺杆菌 Cag A蛋白肽段的基因 ,确定 Cag A蛋白与相应抗体亲和力最强的肽段。 方法 根据幽门螺杆菌 cag A全基因序列以 DNAMAN软件设计 5对引物 ,采用 PCR方法扩增出 5条幽门螺杆菌cag A基因片段。将 PCR扩增产物插入原核表达载体 p GEX- 3X并转化至大肠杆菌 Top10中 ,形成 5种重组质粒。经 PCR、双酶切和测序鉴定后 ,以异丙硫半乳糖苷 (IPTG)诱导其表达 Cag A蛋白肽段。包涵体经 8mol/ L 尿素初步纯化后 ,运用 EL ISA方法检测其抗原性并确定相应抗体亲和力最强的 Cag A蛋白肽段。 结果 5条 cag A基因片段在大肠杆菌中都得到了表达 ,表达的蛋白均具有强弱不等的抗原性 ,其中 6 6 k D的蛋白肽段与抗 Cag A抗体亲和力最强。 结论 6 6 k D的蛋白肽段与抗 Cag

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的将乙型脑炎病毒NS1蛋白基因克隆至pET28-a(+)表达载体,构建原核表达载体pET-NS1,并使该基因在E.coli中高效表达,为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础。方法根据GenBank中提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段,测序后连接pET28-a(+)载体,构建重组表达载体pET-NS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增出了1300bp的基因片段,与预期大小一致,测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体pET28-a(+)并获得高效表达,表达产物分子量约为45kD,Western blot分析表明该表达产物具有良好抗原性。结论该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据。

恙虫病立克次体Sta58主要抗原基因片段的克隆

作者利用其采用ＰＣＲ技术从恙虫病立克次体基因组中扩增出Ｓｔａ５８主要抗原基因的部分片段，约１ｋｂ，克隆入质粒ｐＳＰ７２的ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ位点，建重组质粒ｐＳＰＲＫ９，又将ｐＳＰＲＫ９中的ＡｃｃＩ小片段约５００ｂｐ亚克隆至ｐＳＰ７２构建重组质粒ｐＳＰＲＫ７。以上无性繁殖系的建可为我国开展恙虫病立克次体核酸杂交研究提供特异核酸探针。

人MAGE-3基因片段的克隆与测序

目的克隆表达人MAGE-3基因片段(210～623位碱基),以便研究其对MAGE-3阳性恶性肿瘤的生物学作用。方法为选择靶基因,采用分子生物学软件分析MAGE-3基因抗原表位;并设计MAGE-3靶区域引物。从人肺癌组织标本中提取mRNA,用RT-PCR法从中扩增出MAGE-3片段,对其进行XhoⅠⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM-TEasy载体中,转化JM109,进行阳性筛选后,运用pGEM-TEasy质粒的T7/SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果抗原表位分析表明MAGE-3基因片段(210～623位碱基)为抗原决定簇丰富区段。RNA体外扩增得到的片段为414bp,并经XhoⅠⅡ酶切鉴定得到证实;pGEM-TEasy-MAGE-3经筛选鉴定正确,DNA测序结果与Genebank比较完全相同,表明靶基因成功插入pGEM-TEasy。结论该片段可用于真核及原核表达。

CD40-IgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建人CD40-IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1(+),并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达。方法应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建人CD40膜外段和IgG1Fc段融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1(+),将其转染入CHO细胞株并筛选,进行稳定表达。通过RT-PCR、Western blot法及ELISA法证实融合基因的表达。结果成功构建真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1(+),并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论通过基因工程生产的人CD40-IgG1Fc融合蛋白,能够特异性阻断CD40-CD40L的相互作用。

黑色素瘤相关性抗原E1基因的克隆与测序

目的 克隆表达人黑色素瘤相关性抗原MAGE E1片段 ,以便研究其对神经系统恶性肿瘤的生物学作用。方法 从人胶质瘤细胞系BT 32 5中提取mRNA ,用RT PCR法从中扩增出MAGE E1片段 ,采用DNA重组技术将其克隆于 pGEM TEasy载体中并测序。 结果 RNA体外扩增得到的片段为 4 0 0bp ,PGEM MAGE E1经酶切鉴定正确 ,测序结果与Genebank比较完全相同。

幽门螺杆菌cagA基因片段原核表达载体的构建及其cagA基因和CagA蛋白及感染者血清抗体的检测

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)cagA基因片段的原核表达系统,建立ELISA检测CagA及其抗体,了解表达CagA的Hp菌株(CagA+Hp)感染与所致疾病种类的关系。方法:从快速尿素酶试验阳性的156例患者胃黏膜活检标本中分离Hp。采用PCR检测109株HpcagA基因,并从临床菌株Y06中扩增2148bp的cagA基因片段(cagA1)。构建cagA1原核表达系统,用SDS-PAGE检查目的重组蛋白(rCagA1)的表达情况,用Westernblot和免疫双扩散试验鉴定rCagA1的免疫反应性和抗原性。建立ELISA,检测109株HpCagA表达和相应患者血清中CagA抗体。分析CagA+Hp感染与胃炎和消化性溃疡的关系。结果:80.8%胃黏膜活检标本中分离出Hp(126/156),97.2%的Hp菌株(106/109)cagA基因阳性。与文献报道比较,所克隆的cagA1片段核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.83%和93.30%。所构建的原核表达系统表达的rCagA1量约为细菌总蛋白的30.0%。rCagA1能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔产生双扩散效价为1∶4的抗体。92.6%菌株(101/109)可表达CagA,88.1%患者(96/109)血清CagA抗体阳性。消化性溃疡标本中CagA+Hp菌株分离阳性率(97.9%)高于胃炎标本(88.5%),但无统计学差异(χ2=3.48,P>0.05)。

结核杆菌抗原Ag85A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:将结核分枝杆菌Ag85A抗原基因克隆并在大肠杆菌中表达。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85A抗原基因,然后将其插入到原核表达载体pGEX5T中,构建成pGEX5T-Ag85A重组质粒。经IPTG诱导使该基因在E.coli k802菌中表达,亲和层析法纯化蛋白,Western印迹法验证表达蛋白的抗原性。结果:扩增出了约0.9kb的单一条带,并成功地构建了pGEX5T-Ag85A重组子;经IPTG诱导后,Ag85A蛋白在k802菌中获得了表达,表达的蛋白条带大小约58000,与预期结果相符;纯化后获得了较单一的蛋白条带。蛋白纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别。结论:成功地克隆了Ag85A抗原基因,并将其在大肠杆菌中进行了表达、纯化,为将其应用于结核病诊断和防治的研究奠定了基础。

癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建

目的：将人特异表达的癌胚抗原（ＣＥＡ）－ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒质粒载体ｐＬＸＳＮ中，构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ，为进一步表达表达人ＣＥＡ的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＬＸＳＮ及ｐ９１０２３Ｂ－ＣＥＡ－１７，得到线状载体ｐＬＸＳＮ及外源基因ＣＥＡ－ｃＤＮＡ，然后通过连接酶的连接反应将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ插入到ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点，用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ鉴定。结果：成功地将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ克隆到ｐＬＸＳＮ中，通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ。结论：利用基因克隆技术能将人ＣＥＡ－ｃＤＮＡ定向插入逆转录病毒质粒载体中，构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ，为进一步建立ＣＥＡ阳性动物肿瘤细胞模型及研究ＣＥＡ阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。

细胞核抗原Sm B′的基因克隆和原核表达

目的为建立抗Sm自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定细胞核抗原Sm B′。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从HL-60细胞株中克隆Sm B′全长基因,将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEx-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定。结果PCR产物约为700 bp,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-5T-Sm B′重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和western blot结果显示融合蛋白分子量为51 000,具有与抗Sm B′抗体的反应性。结论成功克隆表达核抗原Sm B′,为建立抗Sm自身抗体检测方法奠定了基础。

稳定表达人CD14细胞系Hela-CD14的建立

目的:建立稳定表达人CD14分子的Hela-CD14细胞系,为研究CD14分子及CD14相关性疾病提供研究材料。方法:以人CD14mRNA为模板,通过RT-PCR法扩增CD14基因,T-A克隆后测序核实CD14基因序列。通过EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切和体外连接法将人CD14基因连接到真核表达载体pcDNA 3.1(+)中,通过转化、克隆得到阳性重组质粒pcDNA 3.1(+)/CD14。将pcDNA 3.1(+)/CD14转染人宫颈癌Hela细胞,经G418筛选、定量PCR(qPCR)和免疫荧光检测CD14基因和蛋白的表达,筛选出稳定表达人CD14阳性的Hela-CD14细胞系。结果:测序显示,扩增到的人CD14基因序列正确,双酶切质粒结果表明,CD14基因成功克隆到pcDNA 3.1(+)载体中;免疫荧光结果显示,人CD14主要以膜蛋白形式在Hela细胞上成功表达。结论:本研究建立了稳定的以膜蛋白形式表达人CD14抗原的细胞系Hela-CD14。

肝癌靶向性T细胞活化融合基因scFv-CD_(3ζ)的构建与表达

目的 :构建抗肝癌单链抗体融合CD3 ζ真核表达载体。 方法 :应用PCR法将二硫键稳定的人源化的单链抗体scFv的基因克隆入真核细胞表达载体pcDNA3 ,在 5′端及 3′端分别引入相应酶切位点 ;用RT PCR法从正常外周血人T细胞扩增出CD3 ζ的胞内区、跨膜区基因 ,然后将其克隆于scFv的下游 ,并在5′端及 3′端引入相应的酶切位点。以脂质体转染法将pcDNA3 scFv CD3 ζ转入T细胞 ,采用免疫细胞化学的方法 ,利用抗CD3 ζ的单克隆抗体检测转染前后T细胞中CD3 ζ的表达。 结果 :二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的cDNA片段为 73 5bp ,与已知的序列相符 ;CD3 ζ的胞内区、跨膜区的cDNA片段为 2 94bp ,与GeneBank公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。转染前后T细胞中CD3 ζ染色强度显著增强。 结论 :完成了二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv及CD3 ζ的胞内区、跨膜区融合基因真核表达载体pcDNA3 scFv CD3 ζ的构建 。

应用聚合酶链反应克隆马立克氏病病毒A抗原基因

根据马立克氏病病毒(MDV)A抗原基因的头尾DNA序列,设计并人工合成了两套用于聚合酶链反应(PCR)的引物(PCR PⅠ和PCR PⅡ、PCR PⅡ和PCR PⅢ)。以pBSA2.2k为模板DNA进行体外聚合酶链反应,选择性地使两引物间DNA片段扩增。将扩增的DNA片段纯化、酶切后与pBS载体连接克隆,经酶切分析得到能分别适用于真核和原核表达系统的MDV A基因。然后将用于原核表达的A抗原基因分步克隆于M13mp18,分别得到M13A0.4、正反向M13A1.0克隆。用双脱氧法进行DNA序列分析,在1408bp处比Causscns原文少1个A,1475bp处多1个A,但与Binus报道的一致。为此将pBSA2.2k质粒中EcoRI-NcoI片段(包含上述两位点)克隆于M13mp18测序,获得相同结果。

恙虫病立克次体sta56基因片段的克隆

应用半套式PCR技术从Karp株恙虫病立克次体基因组中扩增出872hpDNA片段。该片段经Pstl消化后，与经PStl酶解的pUC18连接，转化大肠杆菌，电泳初筛得pUCRL3等重组质粒。pUCRL3经PCR及酶切证实含约294hp恙虫病立克次体sta56基因片段，可作为检测恙虫病立克次休的特异核酸探针。

恙虫病立克次体sta58主要抗原基因片段的克隆及表达

作者设计合成一对ＤＮＡ引物，经ＰＣＲ扩增出Ｋａｒｐ及ＣＭＹ株恙虫病立克次体ｓｔａ５８主要抗原基因片段，分别建立其无性繁殖系，构建了表达质粒ｐＢＶＲＫ５和ｐＢＶＲＣ４５，在国内首次应用大肠杆菌成功表达了恙虫病立克次体抗原。其意义在于为我国恙虫病立克次体研究提供特异性核酸探针，为恙虫病基因工程诊断试剂的研制奠定物质基础。

增殖细胞核抗原反义真核表达载体的构建及其在膀胱癌EJ细胞中的表达

目的 寻求肿瘤反义基因治疗的新途径。方法 应用分子克隆技术构建增殖细胞核抗原 (PCNA)基因反义真核表达载体 ,转染膀胱癌EJ细胞 ,通过免疫荧光、逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)、噻唑蓝 (MTT)比色法、克隆形成实验动态检测转染 1～ 7d后癌细胞PCNA基因表达和体外增殖活性变化。结果 所获反义表达载体 pLAPSN转染可使癌细胞PCNA蛋白、mRNA表达水平分别抑制 16.74%～ 84.2 1% (P <0 .0 5 )、2 3.2 7%～ 86.15 % (P <0 .0 5 ) ,增殖活性抑制2 7.91%～ 62 .0 7% (P <0 .0 1) ,克隆形成能力降低 5 0 .81% (P <0 .0 1)。结论 应用反义RNA技术阻断PCNA基因的表达 ,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性 ,是膀胱癌基因治疗的合理策略之一。

单克隆抗体3H11对应抗原的全长cDNA克隆及表达

目的 克隆能与多种肿瘤细胞特异性地反应 ,且经核素标记已成功试用于肿瘤原发灶和转移灶的临床显像的单克隆抗体 (McAb) 3H11的对应抗原 ,研究其表达分布。方法 在用McAb3H11筛选胃癌细胞MGC 80 3cDNA表达文库 ,获得一段阳性cDNA片段的基础上 ,用cDNA末端快速克隆技术 (RACE)获得对应抗原的全长cDNA。Northernblot研究表达分布。结果 McAb 3H11抗原cDNA长 2 .2kb ,主要分布于肿瘤组织。经序列比较在GenBank中无高度同源基因。同时在制备抗体的过程中发现McAb 3H11抗原在哺乳类体内免疫原性较低。结论 McAb 3H11对应抗原可能是哺乳动物胚胎生长的调节蛋白 ,在肿瘤中恢复表达 ,可能与细胞快速增殖和低分化相关。