抗Ro52抗体和抗Ro60抗体在结缔组织病中的临床价值分析

目的探讨抗Ro52抗体和抗Ro60抗体在结缔组织病(connective tissue disease,CTD)中的临床意义,分析其对结缔组织病相关间质性肺病(CTD associated interstitial lung disease,CTD-ILD)的风险预测价值。方法纳入2019年10月至2021年1月在河北医科大学第二医院风湿免疫科住院并明确诊断为CTD的患者785例,并收集其临床资料。依据患者抗Ro52抗体和抗Ro60抗体的表达情况分为4组:Ro52^(+)Ro60^(-)组(n=94)、Ro52^(-)Ro60^(+)组(n=80)、Ro52^(+)Ro60^(+)组(n=251)和Ro52^(-)Ro60^(-)组(n=360);依据有无ILD将患者分为两组:CTD合并ILD组(n=243)和CTD不合并ILD组(n=542)。比较各组临床资料差异,采用logistic逐步回归进行多因素分析,评估抗Ro52抗体和抗Ro60抗体对CTD,尤其CTD-ILD的临床风险评估。结果患者抗Ro52抗体和抗Ro60抗体表达情况存在差异,不同组别间一般资料、临床症状、细胞因子、免疫球蛋白、补体和自身抗体方面差异均有统计学意义(P<0.05)。男性发生ILD的概率增加了56.7%;年龄每增加1岁,发生ILD的风险将增加3.8%;抗Ro52^(+)Ro60^(-)抗体的CTD患者比其他患者发生ILD的概率高。结论抗Ro52抗体阳性、男性和高龄是CTD患者发生ILD的独立危险因素。抗Ro52和抗Ro60抗体在CTD中作用复杂,应该替代传统的抗SSA抗体分别做为独立的抗体来进行检测。

ROS在齐墩果酸诱导HL-60细胞凋亡中的作用

目的观察ROS在齐墩果酸(OA)诱导HL-60细胞凋亡中的作用。方法分瓶培养细胞,实验设空白对照组和12、24、48 h的OA用药组。收集细胞,提取细胞总蛋白,制备去线粒体细胞浆蛋白,Western印迹法检测caspase-9表达。流式细胞术检测ROS水平。结果 OA处理HL-60细胞后,ROS含量增加,并引起caspase-9的激活。结论 OA使ROS量增加,通过线粒体凋亡信号通路诱导HL-60细胞凋亡。

Ss-A/Ro核蛋白60 ku亚单位在胃癌多药耐药中的作用

目的:对Ro 60在胃癌多药耐药中的功能进行研究．方法:克隆Ro 60编码基因,构建Ro 60编码基因的正义真核表达载体,将其转导入SGC7901 细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素．结果:成功构建了Ro 60正义真核表达载体, 应用脂质体介导法将其转导入SGC7901,Ro 60真核表达载体转染SGC7901细胞后其表达量明显增加,体外药物敏感性试验提示其对长春新碱、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、阿霉素的敏感性减低,SGC7901细胞的IC50值 (mg/L)与未转染细胞和转染空白载体细胞相比,显著增加(2．28±0．11 vs 0．45±0．04,0．65 ±0．05;2．89±0．14 vs 0．61±0．21,0．90±0．11; 1．92±0．03 vs 0．54±0．03,0．75±0．21;1．41± 0．06 vs 0．45±0．03,0．54±0．03;0．28±0．03 vs 0．14±0．01,0．14±0．01;均P<0．01),细胞内阿霉素蓄积显著减少(56．30±2．49 mg/L vs 92．83 ±3．63,87．38±2．94 mg/L,P<0．01)．结论:Ro 60真核表达载体转染SGC7901细胞后显示了一些多药耐药的特性,提示Ro 60在胃癌多药耐药中发挥了一定的作用．

Ss-A／Ro核蛋白60 ku亚单位及其变异体在耐药胃癌细胞中的表达

目的:克隆Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,检测Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其变异体在耐药胃癌细胞中的表达情况．方法:应用RT-PCR克隆Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,应用半定量RT-PCR检测Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其变异体在胃癌细胞中的表达情况．结果:成功克隆了Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,并发现了他的两种变异体,长度分别为52 bp和41 bp．半定量RT- PCR结果显示,Ss-A／Ro 60 ku亚单位在SGC7901／VCR中的表达强度高于SGC7901细胞(P=0．0001),Ss-A／Ro 60 ku亚单位的两种变异体在SGC7901／VCR中的表达强度也高于 SGC7901细胞(P=0．001)．结论:Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其两种变异体为胃癌多药耐药相关分子．

Ss-A/Ro核蛋白60 ku亚单位反义核酸逆转胃癌细胞多药耐药

目的:对Ro 60反义核酸在逆转胃癌细胞多药耐药中作用进行研究．方法:克隆Ro 60编码基因,构建Ro 60编码基因的反义真核表达载体,将其转导入SGC7901细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素．结果:成功构建了Ro 60反义真核表达载体,应用脂质体介导法将其转导入SGC7901-VCR, Ro 60反义真核表达载体转染SGC7901-VCR细胞后,Ro 60的表达量明显下降,体外药物敏感性实验提示其对长春新碱、丝裂霉素、顺铂、阿霉素的敏感性增加,转染反义表达载体的SGC7901-VCR细胞与未转染和转染空载体的细胞相比,IC50值(mg/L)有显著的下降(7．66±0．45 vs 19．56±0．38,17．48±0．85;0．84±0．03 vs 1．62±0．06．1．80±0．03;0．51±0．03 vs 0．87±0．03．0．88±0．03;0．22±0．01 vs 0．52±0．02,0．43±0．03,均P<0．01),细胞内阿霉素蓄积有显著的增加(51．94±1．26 mg／L vs 36．27±0．98,37．01±0．91 mg／L,P<0．01)．结论:Ro 60反义真核表达载体转染SGC7901后能够抑制胃癌细胞的多药耐药表型．

自身抗原Ro-60 cDNA克隆构建及表达

目的：采用基因工程方法克隆并表达自身抗原Ｒｏ－６０融合蛋白。方法：用ＰＣＲ法克隆Ｒｏ－６０多肽分子的ｃＤＮＡ，经测序证实后定向插入表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，并经酶切电泳鉴定。进而导入大肠杆菌ＪＭ１０９中表达重组融合蛋白。结果：经蛋白印迹证实，重组融合蛋白具有Ｒｏ抗原性。结论：重组融合蛋白可用于对Ｒｏ抗原表位的精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性及制备重组抗原用于临床检测。

表达人自身抗原SSA/Ro60重组体的构建及鉴定

目的 :构建表达人自身抗原SSA/Ro6 0的重组体 ,为研究自身免疫病中的抗原抗体作用提供物质基础。方法 :采用逆转录 PCR技术克隆自身抗原SSA/Ro6 0cDNA ,定向插入表达载体PGEX 2T ,并经酶切电泳 ,DNA测序鉴定分析。结果 :经鉴定 ,证明成功构建了表达人自身抗原SSA/Ro6 0的重组体。结论 :SSA/Ro6 0表达型重组体可用于自身抗原SSA/Ro6 0的大量生产并用于诊断。

三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡过程中ROS、NF-κB和C-IAP2的变化

背景与目的:探讨As2O3(arsenic trioxide,ATO)对HL-60细胞凋亡过程中细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、NF-κB(nuclear factor kappa B),及C-IAP2(cellular inhibitor of apoptosis proteins 2)的影响。材料与方法:以7.5μmol/L As2O3单独应用及与500μmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)联合作用于HL-60细胞12、24 h后,流式细胞术检测HL-60细胞ROS的产生量;Western blot法检测NF-κB P65核蛋白的变化情况;半定量RT-PCR法检测C-IAP2的相对表达量。结果:7.5μmol/L的As2O3作用HL-60细胞12、24 h后细胞内ROS的生成增加,与阴性对照比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。NF-κBP65核蛋白的相对含量分别为49.3%±4.4%和23.1%±2.1%,C-IAP2的相对表达分别为72.9%±5.8%和59.3%±4.4%,较对照组均明显降低(P<0.05)。500μmol/L NAC和7.5μmol/L As2O3共同作用HL-60细胞12、24 h后细胞ROS生成量相对减少,与AS2O3单独作用组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);NF-κB P65核蛋白的相对含量分别为65.4%±4.9%和37.1%±3.4%,C-IAP2的相对表达量分别为81.1%±5.8%和73.7%±4.9%。较AS2O3单独作用组均明显增加(P<0.05)。结论:As2O3诱导HL-60细胞凋亡过程中,细胞内ROS生成增加,抑制NF-κB活性,同时下调其靶基因C-IAP2等的表达;NAC能阻断As2O3诱导HL-60细胞凋亡过程中ROS的生成,部分阻断了NF-κB活性的抑制。

Ss-A/Ro 60 ku亚单位变异体1在胃癌多药耐药中的作用

目的:对Ro 60变异体1在胃癌多药耐药中的功能进行研究.方法:克隆Ro 60变异体1编码基因,构建Ro 60变异体1编码基因的正义真核表达载体,将其转导入SGC7901细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素.结果:成功构建Ro 60变异体1正义真核表达载体:应用脂质体介导法将其转导入SGC7901,其表达量明显增加;体外药物敏感性试验提示,与SGC7901和SGC7901-pcDNA3.1细胞相比,转染细胞对长春新碱(IC_(50):2.87±0.10 mg/L vs 0.47±0.07 mg/L,0.63±0.08 mg/L,P<0.01)、5-氟尿嘧啶(IC_(50):3.89±0.12 mg/L vs 0.59±0.17 mg/L,0.92±0.12 mg/L,P<0.01)、丝裂霉素(IC_(50):1.02±0.06 mg/L vs 0.50±0.04 mg/L,0.73±0.09 mg/L,P<0.05)、顺铂(IC_(50):1.15±0.06 mg/L vs 0.46±0.04 mg/L.0.52±0.05 mg/L,P<0.01)、阿霉素(IC_(50):0.45±0.03 mg/L vs 0.15±0.03 mg/L,0.16±0.02 mg/L,P<0.01)的敏感性减低;流式细胞仪检测结果显示,转染细胞内阿霉素的蓄积减少(50.39±2.09 mg/L vs 94.99±4.07 mg/L,88.06±2.67 mg/L,P<0.01).结论:Ro 60变异体1真核表达载体转染SGC7901细胞后,显示多药耐药特性.

SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化

目的 克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化,为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法 采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因,定向插入pPICZ表达载体,转入毕赤酵母表达系统,将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果 扩增出约1.5kb的SSA/Ro60全长序列,获得相对分子质量60×103的重组蛋白,经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60,为诊断自身免疫疾病奠定基础。

敲低Ro60/SSA表达对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响

目的:探讨下调Ro60/SSA的表达对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法:将人肝癌细胞HAK-1A和HepG2分别分3组处理:空白对照组常规培养(DMEM培养基+体积分数10%胎牛血清);另两组脂质体法分别转染siRNA-NC和siRNA-Ro60/SSA,每组设置3个复孔。转染48 h后应用Western blot法检测细胞中Ro60/SSA蛋白的表达,应用克隆形成实验和球形形成实验检测细胞的自我更新和增殖能力;应用Transwell小室法检测3组HAK-1A细胞的迁移和侵袭能力。将雌性BALB/c裸鼠随机分为siRNA-NC组和siRNA-Ro60/SSA组,每组5只。将转染siRNA-NC或siRNA-Ro60/SSA的HAK-1A细胞以1×10^(4)个/μL尾静脉注射入裸鼠体内(200μL/只),4周后,计数肺部肿瘤灶数量。结果:与空白对照组和siRNA-NC组比较,siRNA-Ro60/SSA组HAK-1A和HepG2细胞Ro60/SSA蛋白表达下调,克隆形成数、成球率均降低(P<0.05)。siRNA-Ro60/SSA组HAK-1A细胞Transwell实验中的迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和siRNA-NC组(P<0.05)。siRNA-Ro60/SSA组裸鼠肺部移植瘤数量低于siRNA-NC组(P<0.05)。结论:敲低Ro60/SSA可明显抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力。

亲和层析法纯化系统性红斑狼疮特异性60KDRo/SSA抗原

目的:建立亲和层析法纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法:从猪脾提ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀、离子交换层析进行初步纯化。挑选单纯抗60KDSSA抗体阳性的病人的血清,制备亲和层析柱。用ELISA法检测所制备的抗原。结果: 60KDSSA抗体阳性标准血清ELISA检测为阳性,Sm和RNP、Jo-1、Scl-70的标准抗血清为阴性。结论:该方法可获得高纯度的抗原,可用于ELISA检测等目的。

系统性红斑狼疮特异性抗原60KD Ro/SSA的提取和纯化

目的建立从猪脾纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法从猪脾提取ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀结合离子交换层析分离ENA蛋白组分,并用对流免疫电泳检测60KDSSA抗原的活性,以得到纯化60KDSSA抗原的具体条件。结果60KDSSA抗原在Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中的硫酸铵沉淀范围是硫酸铵饱和度50%～60%。60KDSSA抗原在50mMTris-HCl缓冲液(pH8.3)+NaCl中的DE52离子交换层析洗脱范围为电导值35～40ms/cm。结论结合硫酸铵沉淀和DE52离子交换层析两种纯化方法所得的60KDSSA抗原相对于其它ENA有较高的纯度,并能有效分离中SSA中60KD、52KD两个组分。

人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表达

目的:克隆并表达人自身抗原SSA/Ro60。方法:应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原SSA/Ro60全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot。结果:PCR产物约为1.6 kb,与预期1614 bp接近,测序结果与Genebank报道的完全一致。pGEX-5T-SSA/Ro60重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为86 KD,具有天然人自身抗原SSA/Ro60的免疫原性。结论:成功克隆表达人自身抗原SSA/Ro60,为下一步工作奠定了基础。

Ro60不同表位自身抗体在SLE和pSS淋巴细胞减少中的作用

目的初步探讨Ro60不同表位自身抗体在系统性红斑狼疮(SLE)和原发性干燥综合征(pSS)患者淋巴细胞(LC)减少中的作用。方法 SLE患者16例,pSS患者14例,均为女性,所有患者病情处于活动期,3个月内未接受过糖皮质激素和免疫抑制剂治疗,Ro60抗体阳性,周围血淋巴细胞低于1×109/L,SLE和pSS组LC计数分别为(0.66±0.12)×109/L和(0.70±0.16)×109/L(P=0.511),另选择健康对照者10例。体外培养3组患者的外周血LC,加入Ro60抗原3个不同表位(aa482-493、aa310-323和aa230-241)的免疫毒素(IT)(AE1、AE2和AE3),MTT法分别检测其对患者LC的毒性,分析患者不同表位IT的细胞毒性与LC计数的关系,同时比较检测2组患者周围血相应表位的自身抗体。结果 3个IT对体外培养的对照组LC均有一定毒性,但AE3和AE2分别对SLE和pSS患者的LC表现有显著增强的细胞毒性,且与患者的淋巴细胞减少程度显著相关(SLE组r=0.653,P=0.06;pSS组r=0.594,P=0.025),两组患者的周围血中3个相应表位的自身抗体阳性率并无显著差异。结论 Ro60自身抗体在SLE和pSS患者LC减少中可能发挥作用,但在两种疾病中其作用机制可能不完全相同。

原发性干燥综合征自身抗体谱阳性率比较及ANA、Ro60、SSB、Ro52及唇腺活检联合检测的意义

目的探讨ANA、唇腺组织活检及Ro60、SSB、Ro52等自身抗体的联合检测在原发性干燥综合征(SS)诊断中的意义。方法收集SS患者105例(SS组),同期健康人群110例(健康组),比较两组ANA及各项自身抗体的水平,比较SS组ANA、Ro60、SSB、Ro52及唇腺组织活检联合检测的检出率。结果与健康组相比,SS组ANA及自身抗体Ro60、SSB、Ro52、CENP-B、M2及n RNP/Sm的阳性率更高,其中ANA及自身抗体Ro60、SSB及Ro52差异最为显著(均P<0.05)。联合检测ANA、自身抗体及唇腺活检的阳性率均高于单项检测(均P<0.05)。结论相对其他自身抗体,Ro60、SSB、Ro52对SS的特异性较高;联合检测ANA、自身抗体及唇腺活检可以提高SS的检出率。

Wangzaozin A调节NADPH氧化酶源性活性氧诱导HL-60细胞分化

利用台盼蓝排染法、吉姆萨染色及流式细胞术对对映-贝壳杉烷二萜wangzaozin A影响人早幼粒白血病细胞HL-60生长、细胞形态、NBT还原能力、细胞吞噬及细胞表面抗原CD11b表达进行了检测.结果显示,0.2~0.8μmol/L wangzaozin A抑制HL-60细胞生长,0.6和0.8μmol/L处理组细胞显示了明显的G1期周期阻滞.随着wangzaozin A浓度升高及处理时间延长,细胞核质比减小,肾形核、杆状核和分叶核细胞增多及胞质中颗粒状物质增加;同时,细胞NBT还原能力、吞噬能力及细胞表面抗原CD11b表达显著增强,表明wangzaozin A可诱导HL-60细胞向成熟粒细胞分化.进一步利用荧光探针DCF检测显示0.6和0.8μmol/L wangzaozin A处理细胞12h后细胞内ROS显著升高;抗氧化剂NAC及NADPH氧化酶抑制剂APO显著抑制wangzaozin A诱导HL-60细胞上调CD11b表达,表明wangzaozin A可通过上调NADPH氧化酶源性的活性氧浓度诱导HL-60细胞分化.

C_(60)/Cu^(2+)影响质粒DNA构象的复合效应研究

碳纳米材料的毒性效应日益受到广泛关注,通过比较研究多种非光催化条件下,富勒烯(C60)/Cu2+共存时对质粒DNA构象影响的复合作用,借以评估碳纳米材料的毒性效应。实验结果显示在非光催化条件下,C60/Cu2+可显著诱导DNA构象从超螺旋DNA转变成开环DNA,并且这种剪切效应随C60和Cu2+浓度的升高而增强;断裂后的DNA片段可重新被T4DNA连接酶连接成环状DNA,这说明C60/Cu2+的剪切位点为磷酸二酯键。另外,多种活性氧捕获剂均不能有效消除C60/Cu2+对DNA的剪切作用,这与Cu2+在DNA裂解中起主要作用相关。上述研究结果表明在非光催化条件下,C60/Cu2+可有效诱导DNA断裂,具有明显的复合效应,其潜在的基因毒性值得关注。

Hsp60表达下调通过促进TGFBI分泌增强膀胱癌细胞侵袭转移

目的探索Hsp60蛋白表达对膀胱癌细胞侵袭转移的影响。方法免疫组化检测膀胱癌组织芯片Hsp60蛋白的表达,统计学分析其与膀胱癌患者临床参数的相关性;利用慢病毒载体构建Hsp60稳定干涉的膀胱癌细胞株,Transwell及划痕实验检测Hsp60表达对膀胱癌细胞侵袭转移的影响。RNA-seq分析Hsp60稳定干涉后基因表达的差异,筛选出与侵袭转移相关的基因。Western-bolt及ELISA验证差异基因在蛋白水平的变化,功能学验证差异基因在Hsp60诱导的膀胱癌侵袭转移中的作用,并探索干涉Hsp60表达影响差异基因表达的机制。结果Hsp60蛋白特异性表达在膀胱癌细胞的胞质中,且在浸润性膀胱癌组织中的表达显著降低。统计学结果显示:Hsp60的表达与膀胱癌的转移、临床分级及复发显著相关;细胞学实验证实:干涉Hsp60表达后膀胱癌细胞的侵袭迁移能力显著增强的同时TGFBI的表达及分泌显著升高;利用siRNA阻断Hsp60稳定干涉膀胱癌细胞的TGFBI表达后,可显著抑制Hsp60干涉所造成的膀胱癌细胞侵袭迁移增强。进一步研究发现:Hsp60干涉后膀胱癌细胞线粒体ROS水平及HIF1α的表达均显著升高。利用MitoEMPO降低ROS水平或者利用siRNA阻断HIF1α表达后,Hsp60干涉引起的TGFBI表达及分泌升高可被显著抑制。结论Hsp60表达降低通过促进TGFBI表达增强膀胱癌细胞的侵袭转移,Hsp60表达降低通过ROS/HIF1α信号通路促进TGFBI的表达。

Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的克隆及表达

目的:在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中对Ro60进行克隆,对Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR和药敏胃癌细胞系SGC7901中的表达情况进行比较分析。方法:应用RT-PCR法克隆Ro60的编码基因,通过DNA序列测定对所克隆的基因进行验证。应用半定量RT-PCR法检测Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR和药敏胃癌细胞系SGC7901中的表达情况。结果:在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中,成功克隆了Ro60的编码基因,其DNA序列与Ro60的cDNA序列完全一致。半定量RT-PCR结果显示,Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的表达强度显著高于药敏胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达强度,P<0.01。结论:Ro60在耐药胃癌细胞系中高表达,该分子可能是一种胃癌多药耐药相关分子。