Rosa26-LEM4定点转基因小鼠模型构建

为研究LEM4基因在肿瘤发生发展中的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术,在小鼠基因组的Rosa26位点插入CAG-lox P-STOP-lox P-h LEM4-3×FLAG-IRES-EGFP,建立了Rosa26-LEM4定点转基因小鼠模型.依据小鼠Rosa26位点序列设计合成g RNA、构建含同源序列和目的序列CAG-lox P-STOP-lox P-h LEM4-3×FLAG-IRES-EGFP的插入序列,和Cas9核酸酶m RNA共同注射入小鼠的受精卵中并获得敲入小鼠后代,经Southern blot鉴定、以及PCR扩增插入序列后的序列分析鉴定出F_(0)首建鼠,F_(0)首建鼠与野生型小鼠杂交后获得基因型为Rosa26-LEM4^(flox-LSL/wt)的F_(1)代小鼠.Rosa26-LEM4^(flox-LSL/wt)小鼠自交后获得Rosa26-LEM4^(flox-LSL/flox-LSL)基因型小鼠.Rosa26-LEM4^(flox-LSL/flox-LSL)小鼠与EIIa-cre工具鼠杂交后获得表达人LEM4蛋白的Cre^(+/-);Rosa26-LEM4^(flox-LSL/wt)小鼠模型.该模型的建立为研究LEM4的肿瘤生物学功能提供了材料和思路.

应用CRISPR/Cas9技术构建Tet-on调控表达uPA的人源化肝细胞嵌合小鼠

目的构建Tet-on调控小鼠肝脏特异性表达uPA基因的NOD-SCID背景的转基因小鼠,并通过人肝癌细胞移植修复小鼠亚急性肝损伤进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠。方法采用CRISPR/Cas9技术,在gRNA引导下,Cas9核酸内切酶于Rosa26基因位点切割并编辑,插入目的基因pTight-uPA-pA-Alb promoter-rtTA-pA表达框。使目的基因能跟随染色体稳定遗传,生物学功能保持稳定。新培育的转基因小鼠分为4组:诱导组(n=17)、移植组(n=16)、未诱导组(n=5)和空白对照组(n=5)。诱导组经强力霉素诱导3周,肝脏中表达的uPA能造成小鼠肝脏亚急性损伤;再通过人肝癌细胞移植修复。移植4周后,通过小鼠血清生化学、组织病理学,评估该人源化肝细胞嵌合小鼠的效果。结果诱导组小鼠血清中uPA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)均高于未诱导组和空白对照组(P<0.01);移植组人白蛋白含量显著高于未移植组(P<0.01)。组织病理学HE染色发现人肝癌细胞参与小鼠肝组织的修复,激光共聚焦显微镜观察显示鼠肝脏中有人肝癌细胞聚集并表达人白蛋白,组化染色人角质蛋白(CK18)表达成阳性。结论新构建的转基因小鼠能通过强力霉素诱导小鼠肝脏中uPA表达,造成肝脏亚急性损伤,并通过人源肝癌细胞移植修复进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠。