RCCS中犬成骨细胞-nBGC复合物联合培养的实验研究

目的探讨联合应用成骨细胞、活性玻璃 /胶原纳米复合材料 (nBGC)和旋转式细胞培养系统 (RCCS)体外构建组织工程化骨的可行性。 方法采用骨片组织培养法 ,分离培养犬皮质骨成骨细胞 ,传代培养至第 2代后 ,利用浸泡接种方法 ,形成成骨细胞 -nBGC支架复合物 ,然后在RCCS中培养。扫描电镜观察和上清液分析了解nBGC支架上成骨细胞生长、胞外基质沉积和成骨表型维持的情况。 结果成骨细胞吸附于nBGC支架表面 ,表面可见颗粒状分泌物和丝状胶原纤维 ,形成三维结构的细胞外基质 ;上清液生化分析显示 ,成骨细胞分泌大量Ⅰ型胶原、骨特异性碱性磷酸酶 (B -AKP)和骨钙素 (OCN) ,且分别在 18、2 4和 30d达分泌高峰。 结论nBGC材料和RCCS可以为成骨细胞提供良好的生物学环境 。

RCCS模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞代谢组学的影响

目的探讨旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞代谢组学的影响。方法通过体外培养人胃黏膜上皮GES-1细胞,选取3~10代处于对数生长期细胞进行实验,随机分为模拟微重力组和正常重力组,细胞分组培养1、3、5 d,随后进行LC/MS非靶向代谢组学分析。应用正交偏最小二乘判别分析和两样本独立t检验,寻找2组细胞的差异代谢物;再将差异代谢物输入KEGG数据库,构建代谢通路并进行功能分析。结果2组GES-1细胞经RCCS培养1 d后有151种差异代谢物,其中113种表达上调,38种表达下调;RCCS培养3 d后有134种差异代谢物,其中109种上调,25种下调;RCCS培养5 d后有154种差异代谢物,其中131种表达上调,23种表达下调。通过Venn图筛选出2组1、3、5 d的共同差异代谢物(变量重要性>1且P<0.05)74种,其中57种表达上调,17种表达下调。KEGG数据库分析发现有具体名称及相关功能的差异代谢物44种,主要包括磷脂、氨基酸、辅助因子及羧酸,主要涉及脂类代谢、氨基酸代谢、辅酶和维生素代谢、神经递质代谢、碳水化合物代谢、细胞增殖和凋亡、肿瘤调控、膜转运和信号传导等信号通路。结论RCCS模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞的代谢产生明显影响,主要涉及脂类代谢和膜结构损害、细胞增殖凋亡及肿瘤调控。

兔MSCs-PGA复合物在RCCS中的成骨潜能

目的探讨联合应用兔骨髓基质干细胞 (MSCs)、聚乙醇酸 (PGA)支架材料和成骨诱导因子在旋转式细胞培养系统 (RCCS)中构建组织工程化骨的可行性。 方法利用密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞 ,采用动力接种方法形成骨髓基质干细胞—PGA支架复合物 ,以成骨条件培养液为生长介质 ,在RCCS中进行培养。用趋骨性荧光素四环素标记、茜素红染色以及扫描电镜、透射电镜观察 ,研究细胞—PGA支架在RCCS中的成骨潜能。结果组织化学研究显示 ,兔骨髓基质干细胞—PGA支架结构在RCCS中培养第 7d时 ,茜素红钙质染色呈弱阳性反应 ,至第 2 1d及 2 8d时 ,茜素红钙质染色呈强阳性反应。荧光显微镜下 ,培养组织经趋骨性荧光素四环素标记呈现金黄色荧光 ,荧光亮度与分泌物堆积程度成正相关 ,与钙质染色阳性反应结果一致。超微结构观察 ,见骨髓基质干细胞合成分泌胶原纤维 ,释放基质小泡 ,并出现钙盐沉积 ,形成丛毛球状钙球 ,最终形成骨组织。 结论在旋转式细胞培养系统中 ,骨髓基质干细胞—PGA支架结构具有形成类似活体骨组织特征的组织工程化骨的潜能。

RCCS模拟微重力对人角化细胞代谢组学的影响

目的探讨旋转式细胞培养系统(RCCS)模拟微重力对人永生化角质形成细胞系(HaCaT)细胞代谢组学的影响。方法应用RCCS建立模拟微重力细胞培养系统,体外培养HaCaT细胞,随机分为模拟微重力组(SMG组)和正常重力组(NG组),细胞培养1、2、3 d后收集样本,进行LC/MS代谢组学分析。结合正交偏最小二乘法(O-PLS-DA)和两样本独立t检验寻找两组细胞的差异代谢物,将差异代谢物输入KEGG数据库,进行代谢通路的构建与功能分析。结果 LC/MS代谢组学分析结果显示,与NG组比较,SMG组HaCaT细胞在RCCS模拟微重力环境中培养1 d后共有74种差异代谢物,其中16种表达上调,58种表达下调;2 d后共有89种差异代谢物,其中15种表达上调,74种表达下调;3 d后共有100种差异代谢物,其中23种表达上调,77种表达下调;以表达有统计学差异(VIP>1且P<0.05)的49种代谢物作为目标代谢标记物,其中鞘氨醇、谷氨酸、二十二碳五烯酸下调,脱水山梨糖醇等物质表达上调。KEGG分析显示,其涉及的代谢通路有氨基酸代谢、脂质代谢、细胞增殖和凋亡、物质转运、分解代谢、信号转导等。结论 RCCS模拟微重力环境可对角化细胞代谢产生明显影响,主要涉及鞘脂类、谷氨酸等代谢产物及相关信号通路。

利用RCCS体外快速构建组织工程化骨的实验研究

目的:探讨利用旋转式细胞培养系统(RCCS)在体外快速构建组织工程骨的可行性。方法:将骨髓基质细胞接种于煅烧骨鄄胶原支架上,分别在RCCS和静态环境中进行培养,8、24和72h后取材,细胞计数,检测碱性磷酸酶活性,扫描电镜观察成骨潜能。结果:随培养时间延长,细胞增殖和碱性磷酸酶活性均有所增长,但RCCS组明显高于静态培养组。超微结构观察,可见有颗粒状分泌物和丝状胶原纤维,形成三维结构。结论: 旋转式细胞培养系统是体外快速构建组织工程化骨的理想方法。

灌注式RCCS生物反应器CFD模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响

目的:探讨利用微重力旋转细胞培养系统(RCCS)生物反应器仿真模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响。方法:联立不可压缩牛顿流体连续性方程和动量守恒方程、微载体内以及流动空间中氧的传递和反应方程,设置参数并求解;以Gamb it建立RCCS网格模型,并用F luent软件在欧拉多相模式下进行生物反应器数值模拟及流体力学分析。结果:以微载体直径及RCCS旋转速度作为自变量,基于欧拉-欧拉多相模型和氧运输公式成功建立RCCS数值分析模型。微载体直径和旋转速度均影响细胞培养效率,直径200、300、400μm的微载体旋转速度分别为10、12、14 r/m in;旋转1 h后直径600μm的微载体RCCS中间区平均氧浓度增加85%。结论:CFD可以定量模拟分析影响微载体及氧供的相关因素,为优化培养条件提供参数。

平滑肌细胞在旋转生物反应器内的微载体培养与快速扩增

为获取足够数量活性良好的膀胱平滑肌种子细胞 ,本实验探索在旋转生物反应器内应用微载体技术快速扩增膀胱平滑肌细胞的方法。将培养的第二代新西兰兔膀胱平滑肌细胞应用Cytodex 3微载体在旋转生物反应器(RCCS)内进行动态培养 ,观测平滑肌细胞的生长情况和细胞代谢率 ,进行a 肌动蛋白免疫组化染色 ,并与常规方法培养平滑肌细胞进行比较。结果显示膀胱平滑肌细胞在Cytodex 3微载体上生长迅速、细胞代谢率高、生长倍增时间缩短。在培养第九天 ,细胞数量可达最初接种的 2 3倍。免疫组化显示平滑肌细胞活性良好。结果表明利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增平滑肌细胞 。

模拟微重力对肺T淋巴细胞激活功能的影响

目的探讨模拟微重力对肺T淋巴细胞活化功能的影响及机理。方法分离肺T淋巴细胞,利用的旋转式细胞组织培养系统(RCCS,即旋转生物反应器)模拟微重力条件。培养T淋巴细胞后,采用PepTag非放射性PKC检测试剂盒测定PKC活性;采用免疫组织化学染色观察表达核因子-κB(NF-κB);酶联免疫吸附技术(双抗体夹心ELISA法)测定白介素-2(IL-2)生成;采用流式细胞技术检测表面抗原CD25。结果普通细胞培养容器组培养的T淋巴细胞,刀豆素蛋白A(ConA)组与对照组比较,T淋巴细胞PKC活性增强,NF-κB的免疫组化染色阳性细胞的百分比增加,IL-2生成增加,表面表达CD25的细胞增多(P<0.01);模拟微重力条件下,与普通细胞培养容器培养的T淋巴细胞相比较,ConA刺激后,PKC活性降低,NF-κB免疫组化染色阳性细胞百分比减低,IL-2生成下降,表面表达CD25细胞减少(P<0.01);模拟微重力条件下,加入PKC特异的激动剂PMA,和ConA共同培养的T淋巴细胞组,与同样条件下ConA组相比,PKC活性略增强、NF-κB的免疫组化染色阳性细胞百分比、IL-2生成的量、表面表达CD25增加(P<0.01)。结论模拟微重力条件下,T淋巴细胞的激活受到抑制;PKC的活性降低,表达NF-κB细胞数减少,表面表达CD25的细胞数降低,T淋巴细胞分泌的IL-2降低;同样条件下,PMA对T淋巴细胞的上述指标有部分恢复作用。

香菇多糖对抗模拟微重力环境培养的淋巴细胞免疫功能抑制的实验研究

本研究旨在探索香菇多糖对抗旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)模拟微重力环境下淋巴细胞免疫功能降低的作用。体外分离培养小鼠脾淋巴细胞,在正常重力环境和RCCS模拟微重力环境下分别添加10、20和40μg/ml的香菇多糖溶液,培养24、48和72 h取样,用MTT法、ELISA和流式细胞术分别检测香菇多糖对细胞增殖度、细胞因子分泌量和表面标志表达的影响。结果表明,10、20和40μg/ml香菇多糖在处理时间内对小鼠脾淋巴细胞增殖无明显促进作用;不同浓度的香菇多糖均可提高小鼠脾淋巴细胞在模拟微重力环境下IL-2和IFN-γ的分泌量和促进小鼠脾淋巴细胞表面CD4和CD8分子的表达。结论:香菇多糖具有对抗模拟微重力环境造成的淋巴细胞免疫功能降低的作用。

应用旋转生物反应器批量制备拟胚体的研究

以小鼠胚胎干细胞(ES-D3)为模型,应用新型细胞培养系统--STLV型旋转生物反应器(rotary cell culture system,RCCS)建立一种批量制备拟胚体(embryoid bodies,EBs)的新方法,研究不同细胞接种密度及培养时间对RCCS内EBs产生效率的影响.为了进一步研究该制备方法是否对EBs的分化潜能产生影响,对照传统方法制备的EBs,利用形态学及RT-PCR方法测定经旋转生物反应器制备的EBs在自发性或诱导条件下(1%DMSO)向心肌细胞的分化能力.结果表明:ES-D3在RCCS内能够高效形成EBs,与传统的直接悬浮法比较,其EBs的形成效率可达到后者的2倍.1×104个/ml为最佳细胞接种密度,培养时间也是在RCCS制备EBs过程中的重要因素之一,培养第4～5天为最佳收获EBs的时间.与悬滴法制备的EBs比较,该方法制备的EBs分化为心肌细胞的潜能未改变.由此,应用旋转生物反应器可以高效制备EBs,该方法制备的EBs可以用于发育生物学等基础及应用领域的相关研究.

旋转发生器培养扩增人皮肤成纤维细胞

目的:研究旋转发生器扩增人皮肤成纤维细胞的可行性。方法:利用组织贴壁法从人皮肤中分离出人真皮成纤维细胞(hDFBs),使用DIO标记细胞后结合微载体在旋转发生器(RCCS)中培养,细胞贴附微载体的状况使用荧光显微镜、扫描电镜观测。并且检测细胞周期和分析细胞群体倍增时间,以比较微重力培养与平面培养的体外增殖能力差异。对照组细胞按常规平面培养。结果:在旋转发生器的微重力培养体系中,人成纤维细胞能快速贴附到微载体表面,在培养过程中达到很大的细胞密度,旋转发生器培养的细胞倍增时间为(2.99±0.50)d,对照组为(3.43±0.42)d(P<0.05);旋转发生器培养细胞增殖指数48.2±4.3,对照组35.2±3.4。结论:利用生物反应器和微载体悬浮培养人皮肤成纤维细胞,是大量制备皮肤组织工程种子细胞的一种有效方法。

改良纤维蛋白胶软骨膜块在模拟微重力培养下修复关节软骨缺损

目的观察在模拟微重力条件下改良纤维蛋白胶支架软骨膜块修复关节软骨缺损的影响。方法将兔软骨细胞种植到经抑肽酶和氨甲环酸改良的纤维蛋白胶支架材料上,然后分别在旋转培养仪和培养板中培养,体外培养2周。然后将培养出的软骨膜块植入于动物关节软骨缺损模型中,并设立对照组定期进行大体、组织形态学观察、生化指标检测及组织工程学评分。结果①采用改良支架的复合物经体外培养2周,基本保持了原有塑形;②修复关节软骨效果由好至差的顺序为旋转培养组、普通培养组、单纯改良支架组、空白对照组。组织工程学评分通过统计学处理各组之间存在显著性差异(P=0.01)。结论①经过改良的纤维蛋白胶支架,其降解速率与软骨组织基质形成同步,能长时间支持体内、外软骨组织的形成,并适合旋转培养,是软骨组织工程中适宜的支架;②旋转培养仪提供的模拟微重力环境,可以提高工程化软骨的质量,为实现关节软骨损伤的修复提供有效途径。

旋转生物反应器内微载体大规模扩增肝细胞

目的评估旋转生物反应器(RCCS)内肝细胞微载体大规模培养的可行性。方法为获取足够数量活性良好的肝细胞种子细胞,本实验探索在RCCS内应用微载体技术快速扩增肝细胞的方法。将CL-1细胞和HepFMMU应用Cytodex-3微载体在RCCS内进行动态培养,观测肝细胞的生长情况和细胞代谢率。结果肝细胞在Cytodex-3微载体上生长迅速、生长倍增时间缩短,并保持很高的生物活性。培养至第5天,细胞数量可达最初接种的23倍。细胞的数量在第5天左右达到最高,然后开始下降。功能学检查、倒置显微镜、扫描电镜及MTT均提示细胞功能良好。结论RCCS微载体肝细胞大规模培养是一种可行的细胞快速扩增方法,但对于人工肝庞大的细胞数量和功能需求,应进一步研究,通过优化营养和废物排除,模拟肝脏生理结构,提高细胞培养规模和功能。

永生化软骨细胞体外快速扩增的实验研究

目的 探讨获取大量软骨组织工程种子细胞的方法和技术。方法 通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选、挑选阳性克隆在微载体 RCCS内快速扩增永生化软骨细胞。观测RCCS中微载体培养永生化软骨细胞的生长情况和检测细胞代谢率 ,进行Ⅱ型胶原免疫组化染色 ,并与常规培养方法进行比较。结果 永生化软骨细胞在微载体 RCCS中生长迅速、细胞代谢率高、倍增时间缩短 (P <0 0 1)。在培养第 8天 ,细胞数量可达最初接种的 95倍 (P <0 0 1)。结论 联合应用微载体和RCCS培养技术 ,能够在体外快速。

组织工程复合骨移植材料椎体间脊柱融合实验研究

目的:观察组织工程复合骨移植材料在兔腰椎椎体间脊柱融合的愈合情况。方法:自体骨髓基质细胞体外培养,诱导分化为成骨细胞,种植到多孔钙磷陶瓷载体中,体外旋转细胞培养构建成组织工程复合骨移植材料。实验分为5组:假手术组、空载体组、自体髂骨组、旋转培养复合体组和rhBMP-2复合体组。椎体间移植12周后,通过大体观察、手法检测、影像学、生物力学和组织学方法评价脊柱融合愈合情况。结果:假手术组不能自行达到脊柱融合;空载体移植组脊柱融合率为50%;自体髂骨移植组为66.7%;旋转培养复合体组和rhBMP-2复合体移植组为100%,融合块较大,生物力学强度高。结论:旋转细胞培养方法构建的骨髓基质来源的成骨细胞-钙磷陶瓷复合骨移植材料椎体间脊柱融合率优于自体髂骨移植,可以替代自体髂骨进行椎体间脊柱融合;复合骨移植材料中结合骨生长因子rhBMP-2能够进一步加强脊柱融合的生物力学强度。

肾癌OS-RC-2细胞CD133的表达及意义

目的:培养肾癌干细胞球,研究其表面分子特性。方法:肾癌细胞悬浮于含有表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的无血清培养基中培养,培养7天后收集细胞球,流式细胞仪检测CD133及CD34的表达。结果:悬浮培养2天后出现肾癌干细胞球,培养7天后干细胞球明显增多,流式细胞仪检测发现表达CD133+CD34-细胞约占(8.33±1.26)%,对照肾癌细胞组表达CD133+CD34-细胞只占(1.24±0.36)%;干细胞球通过含10%胎牛血清培养基继续培养,又恢复原来的生长特点。结论:利用无血清悬浮培养方法得到的肾癌干细胞球高表达干细胞表面分子标记CD133。

三维细胞培养技术及相关仪器的进展和应用

三维细胞培养技术应用在生物医学、临床应用和生物制药等领域有重要意义,并讨论与其相关技术装备的进展和应用。

模拟微重力下瘦素对肺T淋巴细胞的信号转导途径MAPK/ERK影响

目的探讨在模拟微重力下瘦素对肺T淋巴细胞MAPK/ERK信号转导途径及增殖影响。方法分离肺T淋巴细胞,利用旋转式细胞组织培养系统(RCCS,即旋转生物反应器)模拟微重力条件。培养T淋巴细胞后,采用蛋白印迹(Western blot)法检测T淋巴细胞磷酸化的ERK和总的ERK蛋白的表达;免疫组织化学染色观察T淋巴细胞表达c-fos;四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法测定T淋巴细胞的增殖反应。结果在普通细胞培养容器组,ConA组与瘦素组、ConA+瘦素组与ConA组相比,磷酸化的ERK蛋白量、c-fos免疫组化染色阳性细胞百分比和淋巴细胞的增殖反应增加(P<0.01),总的ERK蛋白量不变;模拟微重力条件下,与普通细胞培养容器培养的T淋巴细胞相比较,ConA刺激后磷酸化的ERK蛋白量表达减少,总的ERK蛋白量不变,T淋巴细胞的增殖反应降低(P<0.01);瘦素组与ConA组的相同指标相比,上述指标无明显变化,而且加入瘦素的ConA组再与ConA组比较指标仍无明显变化。旋转生物反应器组中的ConA+瘦素组,与普通细胞培养容器组中的ConA+瘦素组相比较,上述指标除总的ERK蛋白量外均降低,有显著差异(P<0.01);且在模拟微重力条件下,瘦素组及ConA+瘦素组的上述所有指标与同样条件下的ConA+PMA组相比均降低(P<0.01)。结论模拟微重力条件下,T淋巴细胞除总的ERK蛋白的量外,磷酸化的ERK、表达c-fos染色阳性细胞百分比、淋巴细胞的增殖反应均降低。模拟微重力条件下,瘦素组及ConA+瘦素组,上述所有指标与同样条件下的ConA+PMA组相比均降低(P<0.01),提示PMA对T淋巴细胞的上述指标有部分恢复作用。

旋转细胞培养系统培养的山羊软骨细胞

目的探讨用旋转细胞培养系统(RCCS)进行大动物软骨细胞扩增的可行性。方法将单层培养的具有正常表型的中国山羊软骨细胞和Cytodex-3微载体放入RCCS的培养容器中,加入DMEM培养基进行培养。在细胞培养的第3、6、9、12天,于倒置显微镜下观察Cytodex-3微载体表面软骨细胞生长形态及增殖变化情况,并对收获的软骨细胞进行蕃红花“O”染色和Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色分析。结果软骨细胞贴附于微载体表面生长,细胞初期呈球形、半球形凸起,逐渐向周围伸展,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多。收获的软骨细胞蕃红花“O”染色呈强阳性,Ⅰ型胶原染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论利用RCCS可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞,培养的软骨细胞具有正常的表型,能特异性分泌软骨组织特有的基质成分。

人肾癌细胞原代培养方法比较及其生长特性观察

目的:分析比较三种方法分离人肾癌组织原代培养肾癌细胞及其传代能力,探讨建立理想的人肾癌细胞体外实验模型。方法:分别采用组织块贴壁法、机械分散法及差速贴壁分离法、混合酶消化法及差速贴壁分离法进行人肾癌细胞的体外培养,并从细胞形态学、表型、增殖生长曲线和细胞活力曲线等方面进行对比研究。结果:三种方法均可获得原代肾癌细胞,采用组织块贴壁法可获得较多数量的肾癌细胞,采用混合酶消化加分步贴壁后培养情况最好,数量较多,形态完整,第4代后肿瘤细胞状态稳定,增殖活跃,有明显的对数生长期,且与肾癌细胞系769-P细胞具有相似的表面抗原表达。结论:采用混合酶消化加分步贴壁法可获得较纯的肿瘤细胞,培养生长时间短,成功率高,适宜体外原代培养。