表达轮状病毒类病毒颗粒的重组毕赤酵母的制备及鉴定

目的制备表达轮状病毒(Rotavirus,RV)类病毒颗粒(Virus-like particle,VLP)的重组巴斯德毕赤酵母。方法优化并合成人RV VP2、VP6、VP4(P8血清型)和VP7(G1血清型)结构基因,分别转入改造的pPIC3.5K质粒,构建pPIC3.5K改-VP7-VP6-VP2-VP4共表达质粒,即重组G1P8质粒,电转化毕赤酵母GS115菌株,甲醇诱导表达。表达产物经Western blot鉴定,并经蔗糖密度梯度离心、分子筛层析和透射电镜观察,分析VLP的形成。结果所构建的重组G1P8质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约41 000;发酵破菌液经分子筛纯化,在180 ml洗脱体积处出现的色谱峰经Western blot鉴定和透射电镜观察,为RV VLP形成的蛋白峰。结论已成功构建了表达RV VLP的重组毕赤酵母菌株,并初步观察到了VLP,为开发新的RV疫苗奠定了基础。

轮状病毒VP7糖蛋白基因的克隆及在毕赤酵母菌中的表达及免疫原性的分析

轮状病毒(Rotavirus,RV)是一种双链核糖核酸病毒,属于呼肠孤病毒科,流行病学调查显示,轮状病毒是秋冬季引起婴幼儿感染性腹泻的重要致病因子,全世界每年有大约一亿人感染该病毒。目前,研制安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段之一。本研究通过基因克隆和重组技术检测20份患儿的粪便标本,提取病毒RNA,再逆转录为cDNA,根据GenBank中发表的VP7全序列设计引物,应用RT-PCR技术,从分离的轮状病毒中扩增出来960bp特异性目的片段,并构建融合表达载体pPICZαA-VP7,转入GS115毕赤酵母中。经1%甲醇诱导,镍柱亲和层析蛋白纯化,获得浓度为0.65mg/mL单一目的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot分析VP7蛋白的表达。结果显示克隆的VP7基因与预计的糖蛋白基因大小一致,构建的重组表达载体在GS115毕赤酵母中表达出分子质量约34kD重组糖蛋白,说明成功克隆和表达了轮状病毒的糖蛋白基因。经小鼠免疫实验结果表明,VP7蛋白加强免疫2周后,肌注组(IM)和滴鼻组(IN)小鼠IgG抗体几何平均滴度分别达到492和676,滴鼻组SIgA平均几何滴度达到43.5,可产生高水平的IFN-γ,表明VP7蛋白免疫可以有效地诱导机体产生细胞免疫,具有进一步开发研究的价值。