MDA-7/IL-24真核表达载体的构建和重组腺病毒的制备及其对肝癌细胞生长抑制作用的研究

目的:构建含有MDA-7基因的的真核表达载体并制备重组腺病毒,转染/感染肝癌细胞后,观察其对细胞增殖的影响。方法:构建MDA-7的真核表达载体,将表达质粒转染肝癌细胞,利用平板克隆形成实验观察MDA-7分子对肿瘤细胞系克隆形成能力的影响。利用Adeasy-1腺病毒重组系统构建、包装并扩增含有MDA-7基因的重组腺病毒。利用MTT实验检测Ad-MDA-7对肿瘤细胞增殖的影响。结果:成功构建了MDA-7真核表达载体,利用平板克隆形成实验证实其可抑制肝癌细胞的克隆形成能力。成功地构建并包装了含有MDA-7基因的重组腺病毒,利用MTT实验证明其可抑制肝癌细胞的增殖。结论:MDA-7对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用,为进一步研究其在肝癌细胞中的功能提供了重要的实验依据。

小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。

mda-7/IL-24腺病毒对小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖的抑制作用研究

目的构建mda-7/IL-24腺病毒,检测其对小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖的影响。方法将mda-7/IL-24cDNA亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,在大肠杆菌BJ5183中将重组病毒穿梭质粒和骨架质粒重组。在HEK293细胞中进行病毒包装和扩增,用PCR方法鉴定后,通过TCID50法测定病毒滴度。用滴度为50pfu/细胞的重组腺病毒Ad·mda-7/IL-24感染NCI-H446细胞72h后,经MTT实验检测其对细胞增殖的影响,并用Westernblot方法检测mda-7/IL-24在NCI-446中的表达。结果核酸序列测定和PCR鉴定表明成功构建Ad·mda-7/IL-24;TCID50法测定扩增的腺病毒滴度为2×1010pfu/ml。Ad·mda-7/IL-24在NCI-H446细胞中表达MDA-7/IL-24,MTT检测表明Ad·mda-7/IL-24明显抑制NCI-H446细胞生长,抑制率为21·37%。结论重组腺病毒Ad·mda-7/IL-24能显著抑制NCI-H446细胞增殖,为研究mda-7/IL-24的作用机制及将其用于小细胞肺癌的基因治疗提供了条件。

宫颈组织HPV E6/E7 mRNA Atg-12 Tie-1表达情况与鳞状上皮内病变病理分级的相关性

目的探讨宫颈组织人类乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA、自噬相关蛋白-12(Atg-12)、酪氨酸激酶受体-1(Tie-1)表达情况与鳞状上皮内病变(SIL)病理分级的相关性。方法选取2020年5月至2021年10月新乡市中心医院病理科诊断为SIL的患者227例,根据宫颈病变分级分为低级别鳞状上皮内病变(LSIL)组124例和高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组103例,另选取子宫肌瘤手术患者80例为对照组。所有患者均采用支链DNA信号扩增法检测HPV E6/E7 mRNA,采用免疫组化法及免疫印迹法检测Atg-12、Tie-1蛋白。分析E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1与病理分级的相关性,绘制受试者特征(ROC)曲线分析各指标对HSIL与LSIL的鉴别诊断价值。结果HSIL组的HPV E6/E7 mRNA、Tie-1蛋白阳性检出率高于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的Atg-12蛋白阳性检出率低于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的HPV E6/E7 mRNA拷贝数、Tie-1蛋白表达量高于LSIL组和对照组(P<0.05),HSIL组的Atg-12蛋白表达量低于LSIL组和对照组(P<0.05)。HPV E6/E7 mRNA、Tie-1蛋白表达量与SIL病理分级呈正相关(r=0.514,0.488),Atg-12蛋白表达量与SIL病理分级呈负相关(r=-0.433)。HPV E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1鉴别诊断HSIL与LSIL的灵敏度为88.57%、74.29%、82.86%,特异度为57.14%、66.67%、64.29%。3项指标联合诊断的灵敏度为77.14%,特异度为85.71%(AUC=0.854)。结论HSIL患者HPV E6/E7 mRNA、Tie-1表达较高,Atg-12表达较低。HPV E6/E7 mRNA、Atg-12、Tie-1表达与SIL病理分级有一定相关性,联合诊断可为HSIL与LSIL的鉴别诊断提供参考。

病毒与肥胖

近年研究表明 ,病毒与肥胖有密切关系。迄今为止 ,经动物实验发现 6种病毒与肥胖有关 ,即犬瘟热病毒、Rous相关病毒 7、博纳病病毒和羊痢疾病毒 ,另外 ,SMAM 1禽类腺病毒和人类 36型腺病毒可导致人类肥胖。大多数病毒诱导肥胖可能是通过神经内分泌网络和 (或 )

携带人黑色素瘤分化相关基因-7／白细胞介素-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24和干扰素联合治疗裸鼠肝癌

目的利用携带人黑色素瘤分化相关基因（MDA）-7／白细胞介素（IL）-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24与干扰素（IFN）联合治疗肝癌裸鼠移植瘤。方法构建携带人MDA-7／IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24，单独使用该病毒或IFN以及两者联合治疗裸鼠肝癌模型，观察其抗肿瘤效应。结果成功构建携带人MDA-7／IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24载体，SG600-IL24＋IFN联合治疗组裸鼠平均生存时间为（111．20±2．60）d，与其他3组[对照组为（35．20±1．53）d，IFN组为（67．60±2．10）d，SG600-IL24组为（59．20±1．16）d]比较生存期明显延长（P〈0．01），且有3例生存时间超过120d，达到长期生存；SG600-IL24＋IFN组裸鼠肝癌体积也明显小于SG600-IL24组或IFN组（P〈0．01）。结论溶瘤腺病毒SG600-IL24联合IFN对裸鼠人肝癌移植瘤模型有协同抗肿瘤作用。

携带人黑色素瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24选择性促进肝癌细胞凋亡和增殖阻滞

目的观察携带人黑色素瘤分化相关基因（MDA）-7/白细胞介素（IL）-24的溶瘤腺病毒SG600-IL24对各种不同转移潜能肝癌细胞HepG2、Hep3B、SMMC7721和正常肝细胞L02的作用。方法将携带人MDA-7/IL-24的溶瘤腺病毒SG600-IL24分别感染人肝癌细胞HepG2、Hep3B、SMMC7721和正常肝细胞L02，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、Western blot检测MDA-7/IL-24基因的表达，噻唑蓝（MTT）观察肝癌细胞的生长抑制，Hoechst 33258和流式细胞仪（FCM）检测细胞的凋亡，FCM检测细胞周期。结果RT-PCR和Western blot显示MDA-7/IL-24在肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达，ELISA提示细胞培养上清液中MDA-7/IL-24蛋白也明显增加。MTT和FCM提示MDA-7/IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长[生长抑制率分别为（75.0±2.5）%、（85.0±2.0）%、（86.0±3.5）%，HepG2：F=5.860，Hep3B：F=7.210，SMMC7721：F=7.980，均P=0.000]，促进肝癌细胞凋亡[凋亡抑制率分别为（56.5±4.0）%、（34.4±2.0）%、（43.3±2.5）%，HepG2：F=203.400，Hep3B：F=313.200，SMMC7721：F=130.500，均P=0.000]，阻滞肝癌细胞在G2/M期[G2/M期阻滞分别为（35.4±4.2）%、（47.3±6.2）%、（40.5±5.0）%]，而对正常肝细胞没有明显的促进凋亡和增殖阻滞作用。结论溶瘤腺病毒SG600-IL24能选择性杀伤不同转移潜能人肝癌细胞和诱导凋亡，促进肝癌细胞增殖阻滞，而对正常肝细胞无明显促进凋亡和增殖阻滞作用。

白细胞介素-17A、成纤维细胞生长因子（basic）及白细胞介素-7与丙型肝炎病毒感染自发清除的相关性

HCV感染是引起肝硬化和肝癌的主要原因之一。在世界范围内，约有1．5亿人感染HCV。在HCV感染急性阶段，15％～45％感染者病毒自发清除，而55％～85％感染者进展为慢性丙型肝炎。每年约有50万人死于丙肝相关肝脏疾病。

MDA-7基因的腺病毒载体构建及对白血病U937细胞凋亡的影响

急性髓系白血病(AML)是常见的急性白血病,患者经治疗有可能治愈,但仍存在复发或继发难治性贫血的危险性。目前的治疗方案不良反应和毒副作用较大,进一步探求有效的治疗方案一直都是AML研究的热点。黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7)自被发现以来,研究显示其对各种肿瘤具有良好的诱导凋亡作用,同时无明显细胞毒性作用[1]。本研究通过构建重组腺病毒载体,增加病毒产率及目的基因表达。

MicroRNA-29b过表达慢病毒载体的构建及其生物学特性的研究

目的:构建针对小鼠microRNA-29b过表达的慢病毒载体,研究其在小鼠神经元GT1-7细胞系中的生物学特性。方法:化学合成两条寡聚核苷酸单链,通过搭桥互补延伸成DNA双链,形成miR-29b的前体结构,将酶切后的慢病毒载体FUGW通过同源重组的方法与miR-29b的前体结构进行连接,构建相应microRNA-29b过表达慢病毒载体,并包装成病毒颗粒后转染小鼠神经元细胞系GT1-7,通过博来霉素药物筛选获得稳转株,RT-PCR检测相关基因在mRNA转录水平上表达量情况。结果:测序图谱证实重组慢病毒表达质粒f-F-miR-29b构建成功,GT1-7细胞稳转株中,miR-29b的表达量与对照组相比提高了约28倍,其靶基因DCX,Vdac1,Pten的表达量有所抑制,性发育相关基因LH-β,kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,GnRH,leptin-R没有明显变化。结论:利用慢病毒筛选的方法,成功在小鼠神经元GT1-7细胞中获得microRNA-29b过表达稳转株,为以后microRNA-29b的生物学特性的研究奠定了基础。

桂枝挥发油及桂皮醛抗流感病毒的机制研究

目的考察桂枝挥发油及其主要成分桂皮醛体外对甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/34(H1N1)的直接杀灭作用,探讨其抗流感病毒作用机制中Toll样受体7(TLR7)信号通路的作用。方法以流感病毒感染的狗肾传代细胞(MDCK)为载体,测定桂枝挥发油及桂皮醛体外抑制流感病毒增殖的半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI);ELISA法检测MDCK细胞干扰素-β(IFN-β)的分泌;RT-PCR法考察MDCK细胞中Toll样受体3(TLR3)、TLR7、肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF-3)、白介素-1受体相关激酶4(IRAK-4)、IFN-β基因的表达。结果桂枝挥发油及桂皮醛对流感病毒有明显的直接杀灭作用,IC50分别为1.85×10 7、5.77×10 7g/mL,TI分别为27.04、9.51。与病毒组比较,桂枝挥发油和桂皮醛0.25×10 5g/mL显著升高感染甲型流感病毒的MDCK细胞上清液中IFN-β的量(P<0.05),显著上调细胞中TLR7、IRAK-4、IFN-βmRNA表达水平(P<0.05)。结论桂枝挥发油及桂皮醛对流感病毒H1N1的增殖有显著抑制作用,作用机制可能与其激活TLR7信号通路、活化IRAK-4、诱导IFN-β高表达有关。