5种结核分枝杆菌Rpf样蛋白的活性鉴定及促生长作用

目的探讨结核分枝杆菌5种Rpf样蛋白(RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE)的生物学活性及其促生长作用。方法根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列分别设计5种Rpf样蛋白特异性引物序列,采用PCR技术扩增目的片段,克隆、表达及纯化结核分枝杆菌的5种Rpf样蛋白,应用获得的Rpf样蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的促生长活性观察。结果成功获得了纯化的五种Rpf重组蛋白,其浓度分别为374.76μg/mL、300μg/mL、116.27μg/mL、306.9μg/mL、349.8μg/mL;促生长效果观察,其中RpfC无明显的促生长活性,RpfE的促生长活性最明显;A、B和D均有一定程度的促进这三种菌生长增殖的作用。结论Rpf样蛋白具有促进结核分枝杆菌增殖的作用,有可能成为一种新型的培养基添加剂,为结核菌的快速培养及相关研究奠定基础。

结核分枝杆菌复苏促进因子基因克隆及其蛋白质的表达

目的通过对结核分枝杆菌复苏促进因子基因的克隆、融合蛋白的表达、纯化，以获得高活性的结核分枝杆菌复苏促进因子蛋白质。为临床标本结核分枝杆菌复苏培养及功能研究提供物质基础。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv的5个复苏因子基因，经内切酶酶切、胶回收，将片段亚克隆到T载体中，转化至DH5α。以PCR鉴定的阳性菌落转至LB中培养，菌液进行质粒提取、酶切、胶回收，回收片段再克隆至表达载体pET30a中，转化至DH5α中。PCR阳性菌落转至LB中培养，测序确定插入片段的正确性，菌液提取质粒，并再转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过适当的IPTG浓度诱导，适宜温度和时间下，诱导蛋白表达，经SDS—PAGE电泳分析，Western blot检测目的蛋白，在最佳条件下大量表达目的蛋白，并纯化。结果获得有活性的高纯度复苏促进因子蛋白，纯度〉90％。结论复苏促进因子蛋白的成功表达为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养最佳方案及复苏基因的功能研究打下良好基础。

复苏因子促进休眠结核杆菌复苏作用的研究

目的研究复苏因子蛋白对休眠结核杆菌的复苏作用,探索对休眠结核杆菌的最佳复苏方案。方法应用含不同浓度复苏因子蛋白的7H9液体培养基培养休眠结核杆菌H37Rv,分别在第6天、第11天、第16天和第30天检测培养物的OD值、并取10μL培养液涂于7H11平板培养、抗酸染色。结果低浓度组合有最佳复苏效果,高浓度复苏因子组合抑制休眠结核菌复苏。低浓度复苏因子A和高、低浓度的复苏因子B、C、E均有不同程度的复苏促进作用,复苏因子D和高浓度的复苏因子A均无复苏作用。重复试验结果相同。结论结核杆菌复苏因子蛋白对结核杆菌有复苏促进作用。

VBNC菌群中好氧反硝化菌种的复苏培养及其脱氮特性

高氨氮废水的生物处理技术因安全高效而备受关注,但反硝化细菌的分离菌源仅限于常规分离培养法所获得的不到1%的微生物,绝大多数菌株因处于活的但非可培养(“viable but non-culturable”,VBNC)状态而未能被发掘。复苏培养VBNC菌群对强化高氨氮废水的生物处理具有重要意义。本文利用复苏促进因子复苏培养高氨氮废水中的VBNC菌株,16S rRNA基因测序对其进行同源性分析,初步鉴定复苏培养的菌株归属于Gordonia和Pseudomonas属。通过测定特殊培养基中硝态氮、亚硝态氮和氨氮的浓度,研究VBNC菌株的好氧反硝化性能,其中,菌株ZYR51的好氧反硝化能力较强。本研究为挖掘潜在具有好氧反硝化性能的VBNC菌种提供了新方法,并为筛选高效去除高氨氮废水的菌种资源提供了新思路。

骨关节结核脓液中结核杆菌的复苏培养

目的探讨骨关节结核脓液中结核杆菌的复苏培养方法。方法应用含不同浓度复苏因子蛋白的7H9液体培养基培养标本，分别在第6天、第11天、第16天、第30天检测培养物的OD值、取10uL涂7H11平板培养、抗酸染色，并同时将标本进行罗氏培养和涂片抗酸染色。结果复苏培养阳性率高于涂片阳性率和罗氏培养阳性率．二者均有统计学显著差异（P〈0．05）；复苏培养平均在第10天进入对数生长期，其OD值与对照组比较有显著性差异（P〈0．01）。结论结核杆菌复苏因子能有效地促进骨关节结核脓液中结核杆菌的生长。

Rpf结构域及其突变体对MTB感染小鼠的免疫治疗作用

目的:观察复苏促生长因子Rpf结构域(Rpfd)及其突变体E54K(Rpfd1),E54A(Rpfd2)和E54K+D48A(Rpfd3)对MTB感染小鼠的免疫治疗作用。方法:表达、纯化Rpfd及其突变体Rpfd1,Rpfd2和Rpfd3。结核毒株H37R v从尾静脉感染BALB/c小鼠,剂量为1×105C F U。感染4w后,随机分为6组,在感染后4w、6w和8周分别腹部皮下注射含50μg/ml相应蛋白Rpfd、Rpfd1、Rpfd2、Rpfd3的生理盐水,同时设异烟肼(INH,54.25 mg/L)联合利福平(RFP,52.5 mg/L)治疗组。在感染后11w和13w,分别取一侧肺脏计数荷菌数。将各时间点的感染小鼠另一侧肺脏固定后进行组织学观察。结果:表达产物均可与抗-Rpf结构域单抗特异性结合,相对分子量约为32 kDa。感染后11w和13w,Rpfd、Rpfd1、Rpfd2治疗组肺部荷菌量明显少于Rpfd3治疗组和生理盐水组(P<0.05),但其对肺部MTB的控制未达到INH+RFP联合治疗的效果(P<0.05)。结论:MTB感染小鼠后,利用Rpfd蛋白进行免疫治疗,发现Rpfd及其突变体Rpfd1和Rpfd2蛋白能够显著的降低肺脏荷菌数,并且诱导淋巴细胞的增值。为利用Rpf结构域突变体制备MTB的免疫治疗疫苗提供了理论依据和实验基础。

拟南芥线粒体RNA加工蛋白(RPF)基因的鉴定及其功能和应用

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)在植物杂交育种中广为应用,其发生与线粒体中的CMS基因有着密切关系。但是由于线粒体基因敲除或下调表达技术手段十分有限,各种作物中大量鉴定出的CMS基因都未能进行功能验证。拟南芥(Arabidopsis thaliana)线粒体RPF(RNA processing factor)蛋白属于PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白家族中的P亚类,由6~8个PPR重复基序组成。每个PPR基序含有35个氨基酸,其第5位和第35位氨基酸对于识别线粒体靶向RNA的一个碱基起到关键作用,由此建立了"PPR密码"规则。拟南芥RPF蛋白以序列识别的方式结合并加工线粒体RNA转录本的5′末端,但目前尚不清楚该加工过程的具体细节及其生理功能。本文综述了RPF蛋白编码基因RPF1~RPF7的鉴定及其功能分析,以及利用人工设计的RPF2蛋白使线粒体基因nad6下调表达的研究进展。植物线粒体RPF蛋白编码基因的鉴定及其功能和应用,对于阐明线粒体mRNA 5′末端加工的分子机制,以及利用反向遗传学手段研究线粒体基因功能,具有重要的科学意义和应用前景。