萝卜RsCYP86MF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

本研究通过设计保守的基因特异引物,运用SMARTRACERT-PCR技术从‘圆白’萝卜中 获得一个细胞色素P450基因,命名为RsCYP86MF,其cDNA全长1818bp,含有1581bp的完整开放阅读 框,编码526个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与白菜的细胞色素P450基因编码的氨基酸序列同源性高达 90%,且有很高的功能区段保守性;对其可能编码的蛋白质二级结构进行预测发现,该蛋白质具有细胞色 素P450典型的保守结构域FNAGPRLCIG,及N-糖基化位点等结构域。

十字花科植物CYP86MF基因同源序列的克隆与进化分析

为了从分子水平上阐明十字花科植物间的亲缘进化关系,给植物种质资源的创建提供理论依据,实验根据课题组已报道的CYP86MF基因编码的氨基酸保守区域设计特异引物,运用PCR技术分别从十字花科6个属11个物种中分离克隆到了CYP86MF基因的同源序列。经比较分析,结果表明:这些同源序列的相似性达80%以上,所推导的氨基酸序列相似性达70%以上,且两者种间差异分别为1.0%～5.7%和2.6%～7.3%,属间差异分别是5.6%～22.5%和7.3%～31.2%;由氨基酸序列构建的分子系统树可知,在亲缘进化关系上芸薹属与萝卜属较近,其他依次为蔊菜属、拟南芥属、荠菜属,而与诸葛菜属最远。因此,CYP86MF基因的核苷酸及其可能编码的氨基酸序列差异属间较种间大,它可用于属间的分类等级研究。

反义CYP86MF基因植物表达载体的构建及其对白菜的转化

在获得一个与白菜核雄性不育相关的编码细胞色素P450(CYP450)的基因CYP86MF的基础上,采用PCR技术在该基因的内部第901个碱基至第1338个碱基之间设计引物,扩增出438bp序列作为反义基因片段.把该反义片段连接至pBI121双元载体质粒上得到CaMV35S组成型启动子的表达载体pBI35S-AMF,随后利用"三亲杂交"法将pBI35S-AMF质粒转入农杆菌LBA4404和EHA105两个菌株中.PCR扩增和酶切鉴定结果表明,所构建的反义CYP86MF基因植物表达载体pBI35S-AMF是正确的,并已成功导入了根癌农杆菌中.随后,按照已建立的遗传转化体系对'上海青'白菜进行了转化,并获得130了多株转化再生植株.

诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析

为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。