干热胁迫下紫花苜蓿Rubisco羧化酶和活化酶活性变化及其基因表达的研究

为探讨核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)和Rubisco活化酶(Rubisco activase,RCA)活性变化及其基因表达,本研究以云南野生紫花苜蓿(Medicago sativa)和‘阿尔冈金’紫花苜蓿为材料,测定其在干旱和高温条件下植株叶片Rubisco和RCA酶活性,并采用RT-qPCR分析Rubisco大亚基(rbcL)和Rubisco活化酶基因(rca)对干热胁迫的响应。结果表明随干热胁迫时间的延长,野生紫花苜蓿的Rubisco酶活性总体高于‘阿尔冈金’,且野生紫花苜蓿中的RCA酶活性对干热胁迫的响应时间较‘阿尔冈金’晚。rbcL基因和rca基因表达量受干热胁迫影响起初显著上升,而后随干热胁迫时间的延长持续降低,但野生紫花苜蓿的基因表达水平总体高于‘阿尔冈金’。2种酶活性与其基因表达之间的相关性均不显著,而rbc L和rac基因之间的表达量均呈显著正相关。

光照强度对山药光合特性的影响和Rubisco羧化酶基因的克隆及表达分析

核糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用中参与CO_(2)同化的关键酶,Rubisco酶的活化取决于Rubisco活化酶(rubisco activase,RCA)的活性。为探讨不同光照强度下山药形态结构变化和生理响应特征,本试验以‘大和长芋’山药为材料,研究在全光照及2种不同透光率T1(60%~75%FL)、T2(30%~45%FL)下山药叶片形态结构、光合特性及块茎淀粉积累相关指标,采用RT-PCR技术克隆山药Rubisco羧化酶基因,并分析其表达模式。结果表明:山药在遮光下,叶面积分别增大17.2%和33.43%;对气孔开度的变化显著,叶片厚度显著降低且上表皮厚度也明显减少,栅栏组织细胞彼此融合而变粗,海绵组织细胞排列较稀疏。净光合速率、蒸腾速率和气孔导度随光照强度的降低而减小,胞间CO_(2)浓度没有明显变化;叶绿素含量显著上升以及Rubisco、RCA酶活力下降。遮光影响块茎的膨大,淀粉、蔗糖含量及相关酶活性呈不同程度的降低。山药Rubisco羧化酶基因(DoRbcL)的ORF长度为1752 bp,编码583个氨基酸,与几内亚薯蓣的氨基酸序列相似度较高。DoRbcL基因呈组织特异性表达,在叶中表达量最高且遮光后基因表达量显著降低,且与遮光程度呈正相关。这为解析山药对光照变化的适应性和响应机制提供了理论依据。

重庆地区马唐种群对2种乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂的敏感性

为高效科学防除重庆地区马唐Digitaria sanguinalis(L.)Scop.,采用整株生物测定法,测定了不同马唐种群对2种乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂的ED_(50)和相对抗性倍数(RI)。结果表明,不同马唐种群对噁唑酰草胺、烯草酮均产生了不同程度的抗性(相对敏感种群除外);DJSP02对噁唑酰草胺、烯草酮分别表现为中抗(RI=8.78)和低抗(RI=2.10),其ED_(50)分别为377.31 g/hm^(2)和37.97 g/hm^(2);DJSP03对噁唑酰草胺、烯草酮分别表现为低抗(RI=3.18)和中抗(RI=7.56),其ED_(50)分别为136.84 g/hm^(2)和136.93 g/hm^(2),均已产生了正交互抗性。因此,在对重庆地区抗性马唐种群进行防除时宜与其他类型的除草剂混用或交替使用。

乙酰辅酶A羧化酶2通过调控细胞周期促进肝癌细胞增殖

目的:研究乙酰辅酶A羧化酶2(acetyl-co carboxylase 2,ACC2)对肝癌细胞增殖、迁移能力的影响以及其潜在的作用机制。方法:通过TCGA、GEO、CPTAC数据库对ACC2在肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者肝脏组织中的表达和预后价值进行分析。采用CRISPR-Cas9系统构建了ACC2敲低肝癌细胞系,观察肝癌细胞增殖、迁移能力以及细胞周期的变化,Western blot实验检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:ACC2在肝癌组织中低表达(P<0.05)且与预后不良相关(P<0.05)。体外细胞功能学实验表明降低ACC2表达显著促进肝癌细胞增殖、迁移能力(P<0.05)。细胞周期流式分析显示敲低ACC2促进肝癌细胞周期G1/S期的转变(P<0.05),细胞周期相关蛋白中CyclinE2和p21的表达降低,而CyclinA2和p-RB的表达升高。结论:ACC2可以促进肝癌细胞增殖和迁移的能力,对细胞增殖的促进作用是通过加速肝癌细胞周期G1向S期的转化实现的。

敲低乙酰辅酶A羧化酶1对食管鳞状细胞癌KYSE450细胞迁移的影响及机制

目的探讨敲低乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)对食管鳞状细胞癌KYSE450细胞迁移能力的影响及机制。方法将对数生长期食管鳞状细胞癌KYSE450细胞随机分为shNC组、shACC1组、shNC+AEB071组及shACC1+AEB071组,shNC组KYSE450细胞转染空白质粒载体,shACC1组KYSE450细胞转染慢病毒质粒载体,shNC+AEB071组KYSE450细胞转染空白质粒载体后加入5μL浓度为2 mmoL·L^(-1)的蛋白激酶C抑制剂AEB071(终浓度为5μmoL·L^(-1)),shACC1+AEB071组KYSE450细胞转染慢病毒质粒载体后加入5μL浓度为2 mmoL·L^(-1)的蛋白激酶C抑制剂AEB071(终浓度为5μmoL·L^(-1))。Transwell法检测各组KYSE450细胞迁移能力;显微镜下观察各组KYSE450细胞形态学变化;Western blot检测4组KYSE450细胞中乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、组蛋白H3(H3)、乙酰化的组蛋白H3第9赖氨酸(H3K9Ac)及上皮-间质转化(EMT)标志物β-连环蛋白(β-catenin)、波形蛋白(Vimentin)以及锌指转录因子(Snail)等的表达。结果shACC1组KYSE450细胞迁移数显著高于shNC组(P<0.05);shNC+AEB071组与shNC组KYSE450细胞迁移数比较差异无统计学意义(P>0.05);shACC1+AEB071组KYSE450细胞迁移数显著低于shACC1组(P<0.05)。shNC组KYSE450细胞呈椭圆形上皮样细胞形态,shACC1组KYSE450细胞呈类似于梭形的间质样细胞形态,shNC+AEB071组和shACC1+AEB071组KYSE450细胞呈椭圆形上皮样细胞形态。shACC1组KYSE450细胞中ACC1相对表达量显著低于shNC组(P<0.05),β-catenin、Vimentin、Snail的相对表达量及H3K9Ac/H3比值显著高于shNC组(P<0.05);shNC+AEB071组与shNC组KYSE450细胞中ACC1、β-catenin、Vimentin、Snail相对表达量及H3K9Ac/H3比值比较差异无统计学意义(P>0.05);shACC1+AEB071组KYSE450细胞中β-catenin、Vimentin、Snail的相对表达量及H3K9Ac/H3比值显著低于shACC1组(P<0.05);shACC1+AEB071组与shACC1组KYSE450细胞中ACC1相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论敲低ACC1可促进食管鳞状细胞癌KYSE450细胞的迁移,从而促进肿瘤的进展,其机制可能是通过蛋白激酶C相关信号通路介导的。

3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症6例患儿的临床特征及遗传学分析

目的探讨3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency,MCCD)患儿的临床及遗传学特征。方法回顾性分析2018年1月-2023年10月就诊于郑州大学附属儿童医院的6例MCCD患儿的临床表现及基因检测结果。结果6例MCCD患儿中,男性4例,女性2例,平均就诊年龄为7 d,平均确诊年龄为45 d。1例小便气味异常,5例无临床症状。6例患儿血3-羟基异戊酰肉碱、尿3-羟基异戊酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸均增高,5例伴游离肉碱降低。共检出MCCC1基因变异6个:c.1630del(p.R544Dfs*2)、c.269A>G(p.D90G)、c.1609T>A(p.F537I)、c.639+2T>A、c.761+1G>T、c.1331G>A(p.R444H),以及MCCC2基因变异3个:c.838G>T(p.D280Y)、c.592C>T(p.Q198*,366)、c.1342G>A(p.G448A),其中MCCC1基因c.269A>G(p.D90G)、c.1609T>A(p.F537I)未见文献报道。1例为母源性MCCD,患儿携带来自母亲的一个杂合变异。5例伴游离肉碱降低患儿予补充左卡尼汀,末次随访时游离肉碱均恢复至正常水平。结论MCCC1基因c.269A>G(p.D90G)、c.1609T>A(p.F537I)为新发现的变异,丰富了MCCC1基因变异谱。血氨基酸及酰基肉碱谱和尿有机酸谱联合基因检测有助于MCCD早期诊断和治疗,并为遗传咨询提供参考。

1例全羧化酶合成酶缺乏症的诊断及治疗

目的总结全羧化酶合成酶缺乏症(holocarboxylase synthetas deficiency,HLCSD)的诊断及治疗方法。方法对1例HLCSD患儿的临床资料作回顾性分析。结果女性患儿,因“呕吐2天,哭闹不安”入院,入院时体检发现四肢凉及皮肤花纹等神经系统感染症状,实验室检查结果为重度代谢性酸中毒,血串联质谱检测结果为血甲基丙二酰肉碱/3-羟基-异戊酰肉碱(C4DC+C5OH)、丙酰肉碱(C3)及C3/乙酰肉碱(C2)等水平升高,尿气相色谱-质谱检测结果为3-羟基丙酸、3-羟基异戊酸及3-甲基巴豆酰甘氨酸等水平升高,拟诊断为多种羧化酶缺乏症。为进一步明确诊断,进行全外显子组基因测序,患儿存在HLCS基因c.1522C>T、c.782delG突变,其中c.1522C>T突变来源于父亲,c.782delG突变来源于母亲,最终诊断为HLCSD。对患儿予生物素10 mg/d、左卡尼汀50~100 mg/(kg·d)口服,患儿哭闹、四肢凉及皮肤花纹等症状缓解。出院后予每日口服生物素20 mg,静脉滴注左卡尼汀3.3 mL,患儿血、尿代谢产物水平正常,体格发育、神经和精神发育等正常。结论HLCSD患儿主要表现为重度代谢性酸中毒、血串联质谱C4DC+C5OH、C3及C3/C2升高和尿气相色谱—质谱多个尿有机酸特异性指标升高,HLCS基因存在c.1522C>T、c.782delG突变。血串联质谱及尿GC-MS检测结果存在特异性指标异常及基因检测结果存在HLCS基因突变可明确HLCSD诊断。生物素联合左卡尼汀口服治疗HLCSD效果较好,能改善HLCSD患儿的临床症状。

乙酰辅酶A羧化酶相关树突状细胞标记预测肝癌患者的预后及潜在治疗药物识别

目的研究乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coa carboxylase 1,ACACA)基因在肝癌中的表达、预后价值及其与免疫细胞的相关性,构建肝癌预后模型。方法整合基因型组织表达(genotype-tissue expression,GTEx)数据库和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据分析ACACA基因在癌症及癌旁组织的表达差异,预后分析。分析ACACA与免疫细胞的相关性。使用GSE156625单细胞转录组测序(single cell RNA seq,scRNA-seq)数据研究ACACA在树突状细胞(dendritic cells,DCs)中的表达。建立基于载脂蛋白C-Ⅰ(apolipoprotein c-Ⅰ,APOC1)和载脂蛋白C-Ⅲ(apolipoprotein c-Ⅲ,APOC3)的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)预后模型,使用Kaplan-Meier生存曲线和时间依赖性受试者操作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线评估预后能力,并通过分子对接分析中药成分在APOC1和APOC3中的作用。结果ACACA在多种癌症中表达差异显著,与肝癌预后相关。高表达ACACA降低树突状细胞含量。APOC1和APOC3是主要DCs标记基因,与ACACA表达正相关。基于APOC1和APOC3的原发性HCC预后模型具有中等的敏感性和特异性。使用列线图预测TCGA队列中肝癌患者的1年,3年和5年总生存期(overall survival,OS)的可能性,并通过校准曲线分析证实了其可靠性。Salvianolic acid B、Asiaticoside和Neohesperidin可能对APOC1和APOC3具有作用潜力。结论ACACA与肝癌预后密切相关,基于APOC1和APOC3的预后模型可作为预测指标,部分中药成分可能对肝癌治疗有潜力。

高温、CO_2加富对温室嫁接黄瓜形态特征、净光合速率和Rubisco羧化酶活性的影响

试验通过高温、CO2加富下对温室嫁接黄瓜的形态特征、净光合速率、Rubisco羧化酶日变化及其不同时间内Rubisco羧化酶变化进行测定分析,旨在为夏秋季温室黄瓜高产优质栽培提供理论依据。结果表明,高温、CO2加富下温室嫁接黄瓜植株生长旺盛,株高、茎粗、叶面积、叶片厚度均明显高于其他处理。经过高温、CO2处理后的温室嫁接黄瓜,其Rubisco羧化酶活性日变化呈"双峰"曲线,第一个峰出现在上午9:00前后,第二个峰在下午15:00左右,并在两峰间13:00达到低谷,其日变化始终高于其他处理。常温条件下,CO2加富后在较低温度时(9:00),会抑制Rubisco羧化酶的活性,而温度升高后(13:00和15:00),可以提高Rubisco羧化酶的活性。单纯的高温会抑制Rubi-sco羧化酶的活性,而CO2加富后,可以提高Rubisco羧化酶的活性,显著地高于对照与常温、CO2处理。高温、CO2处理温室嫁接黄瓜净光合速率的变化与其Rubisco羧化酶活性的变化呈显著的正相关关系。CO2加富可以增加温室嫁接黄瓜叶片的净光合速率,即使9:00羧化酶的活性较低时,净光合速率也高于对照和单纯高温处理。CO2加富配合高温可以更有效地提高温室嫁接黄瓜的光合作用,进而促进了温室嫁接黄瓜植株的生长。

5-苯基-1,2,4-噁二唑衍生物的合成及其作为乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的生物活性

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase,ACC)是一种脂肪酸合成限速酶,是肿瘤治疗的热门靶点之一。本文以3-氯苯胺和亚甲基丁二酸为起始原料,经环化、缩合和酰胺化等反应获得了一系列5-苯基-1,2,4-噁二唑类化合物(9a~9i),其中,化合物9a、9b、9e~9h为全新结构,经^(1)H MNR、^(13)C MNR和MS(ESI)进行了表征。通过Molsoft软件计算目标化合物9a~9i的脂水分配系数和类药性分数,使用ADP-Glo^(TM)激酶检测试剂盒检测化合物ACC抑制活性。结果表明:化合物9g在10μM浓度下对ACC抑制活性达到95.26%,与阳性对照药CP-640186相当。

新生儿筛查C5-OH异常确诊2例3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症

目的探讨新生儿筛查3-羟基异戊酰肉碱(C5-OH)异常联合尿有机酸、基因突变检测进行疾病鉴别诊断。方法选取2019年10月至2022年9月在中国科学院大学深圳医院(光明)进行遗传代谢病筛查的14例初筛3-羟基异戊酰肉碱(C5-OH)浓度高于阳性临界值(0.45μmol/L)的新生儿为研究对象;初筛采用串联质谱法,辅助及鉴别诊断使用气相色谱-质谱联用法和高通量测序技术检测基因突变,结合随访资料进行临床诊断。结果根据14例新生儿的实验室检测结果并结合随访资料临床诊断出2例无症状3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(MCCD)新生儿。其中1例行尿有机酸检测发现3-羟基异戊酸(171.45μmol/L),3-甲基巴豆酰甘氨酸(43.08μmol/L)含量升高;行基因突变检测时在MCCC2基因中发现2个意义未明杂合突变(5:70898419*,NM_022132.4,c.470A>G;5:70939676*,NM_022132.4,c.1103G>A);另1例行基因突变检测时在MCCC1基因中发现1个致病杂合变异(3:182755082,NM_020166.3,c.1518delG)和1个意义未明的杂合变异(3:182817330*,NM_020166.3,c.-102C>T)。结论C5-OH异常提示多种遗传代谢病,但需联合尿液有机酸、基因检测等技术进行鉴别诊断。

1例父源性3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症的临床特点及家系分析

目的报道1例新生儿疾病筛查发现父源性3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency,MCCD)的临床特点、基因诊断及家系分析。方法回顾性分析1例新生儿疾病筛查发现3-羟基异戊酰肉碱(3-hydroxyisovalerylcarnitine,C5OH)增高的新生儿,尿有机酸分析及基因检测证实为父源性MCCD。结果该新生儿初筛血串联质谱C5OH轻度增高,尿有机酸结果正常,其父亲血串联质谱示C5OH明显增高,血浆游离肉碱降低,母亲血串联质谱正常。基因分析结果证实新生儿为MCCC1基因c.980C>G(p.Ser327Ter)杂合变异,其父亲为MCCC1基因c.980C>G(p.Ser327Ter)纯合无义变异。结论新生儿筛查发现持续轻度C5OH水平升高的情况时应考虑父源性MCCD。定期随访仍然是MCCD治疗管理的重心。

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)

文章就核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的分布、结构、性质、分类与功能的研究进展作了介绍。

不同光质对烟草叶片组织结构及Rubisco羧化酶活性和rbc、rca基因表达的影响

通过对烟草植株覆盖白、红、黄、蓝、紫色滤膜获得不同光质,研究了烟草叶片在7～70d的生长发育期内,不同光质处理对烟叶组织结构特征、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)羧化酶活性、Rubisco基因(rbc)表达及其活化酶(Rca)基因(rca)表达的影响。结果表明,与黄膜处理下生长的烟叶相比,红、蓝、紫膜处理下生长的烟叶有较高的叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅栏细胞密度和较小的组织空隙率。此外,红、蓝、紫膜处理的叶片有较高的Rubis-co羧化酶活性和净光合速率及较强的rbc和rca基因表达。实验结果表明不同光质对烟草叶片的组织结构特征有显著影响,光质可能通过影响Rubisco羧化酶活性进而影响叶片光合效率,而光质、叶片组织结构和光合效率之间存在某种程度的相互联系。

罕见病研究:HLCS基因突变致全羧化酶合成酶缺乏症

男性患儿,16月龄,因发现头面部红斑15个月,外阴红斑10个月,加重5 d就诊。患儿新生儿期即出现口周、眼周红斑,婴儿期出现颈部、腋下、外阴三角区等腔口和皱褶部位的红斑、丘疹,可见脱屑和糜烂。血气分析提示代谢性酸中毒,血遗传代谢病氨基酸和酰基肉碱谱分析、尿液有机酸分析结果均提示多种羧化酶缺乏症,基因检测结果提示HLCS基因存在c.1522C>T(p.R508W)纯合突变。最终该患儿诊断为全羧化酶合成酶缺乏症,口服生物素治疗取得良好的临床疗效。该文总结了1例全羧化酶合成酶缺乏症患儿的临床资料,对其病因、诊断、治疗进行归纳总结,为临床医生诊断该类罕见疾病提供思路。

水生植物RuBisCO基因的趋同演化

植物碳固定,作为碳循环中的核心环节,对全球粮食产量与气候变迁具有深远影响。在此过程中,核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)的作用举足轻重。其催化速率与特异性间存在微妙的平衡:特异性降低,催化速率上升,但副反应中的有毒副产物亦随之增多,从而影响整体效率。然而,水生植物却拥有独特的CO2富集机制,有效减少了副反应的影响,为酶创造了优越的工作环境。本文以高等水生植物入水事件为切入点,深入研究了其核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基蛋白的趋同进化。旨在寻找与入水事件紧密相关的趋同进化位点,并探究CO2富集机制下该酶理化性质的变化,为酶的优化提供新思路。收集了泽泻目、唇形目、虎耳草目、水韭目、山茱萸目和金鱼藻目等6个目共48个物种的酶蛋白质序列信息,并确定了6次关键的入水事件。采用PCOC分析方法,整合了这6次入水事件的数据,深入剖析了水生植物的进化趋势。分析结果显示,水生植物中可能存在一个关键的趋同进化位点,位于蛋白质序列的第328号位置,紧邻酶的活性中心。推测该位点的替换可能增强了反应底物进入活性中心区域的灵活性,使CO2更易进入,从而提升了酶的催化速率。这一发现为后续的酶改进突变实验指明了方向,提供了坚实的理论依据。研究成果不仅有助于优化该酶的催化效率和适应性,也为深入研究植物碳固定机制提供了新的视角。

产油核桃内生细菌乙酰辅酶A羧化酶acb基因克隆及优化表达

为了探究细菌异质性乙酰辅酶A羧化酶β亚基生物活性及其对乙酰辅酶A羧化酶酶活影响,以高产油核桃内生细菌B.subtilis HB1310基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增其乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基(β-CT)基因(acb基因),构建pET-28a-acb载体并在E.coli BL21中表达,进一步对乙酰辅酶A羧化酶acb基因的诱导表达条件进行了优化。结果表明:乙酰辅酶A羧化酶acb基因在E.coli BL21中实现了表达,分子质量在25~35 kDa之间;重组蛋白最佳诱导表达条件为诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度1.0 mmol/L、诱导时间6 h、诱导初始pH 8.0,在此条件下工程菌的乙酰辅酶A羧化酶活性可达(4.11±0.03) U/mL,较野生菌提高39.7%。综上,乙酰辅酶A羧化酶β-CT为具有较好生物活性的乙酰辅酶A羧化酶亚基。

EMS诱变创制水稻抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂种质

创制非转基因抗除草剂水稻种质资源对于稻田杂草防控具有重要价值。本研究以甲基磺酸乙酯(EMS)水溶液诱变镇糯19水稻种子,获得1株能稳定遗传的可耐受乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂类除草剂高效盖草能的M 3代水稻幼苗(突变体)。分别扩增镇糯19野生型和突变体的基因组DNA并进行测序和序列比对,发现突变体ACCase基因的开放阅读框(ORF)的第5374位碱基发生了点突变,导致编码的第1792位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸。镇糯19野生型和突变体分蘖盛期大田喷施3种田间推荐剂量的ACCase抑制剂类除草剂后农艺性状调查结果表明突变体对高效盖草能、精喹禾灵和唑啉草酯抗性明显高于野生型。本研究获得了能稳定遗传的非转基因抗ACCase抑制剂类水稻新种质,具有一定的应用价值,为抗除草剂水稻育种提供了种质资源。

单增李斯特菌感染并调控宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)的研究

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)表达的相互影响机制,本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染HeLa细胞5 h后,利用qRT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化,结果显示LM-EGD-e感染HeLa细胞中Pcca基因的转录水平无明显变化(log2FC=-0.305);采用相应试剂盒分别提取感染后的HeLa细胞蛋白和线粒体蛋白,采用western blot检测PCCA蛋白表达变化,结果显示,LM-EGD-e感染后的HeLa细胞中,以及线粒体中PCCA蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。PCR扩增Pcca基因后构建pCMV-N-HA-PCCA重组质粒,并经PCR和测序鉴定正确后转染HeLa细胞中过表达PCCA蛋白后,利用qRT-PCR检测HeLa细胞中Pcca基因的转录水平,收集细胞总蛋白采用western blot检测PCCA蛋白表达水平,结果显示,与转染空载体的细胞相比,转染重组质粒的HeLa细胞中Pcca基因的转录水平上调(log2FC=8.454),且细胞内PCCA蛋白表达量显著增加(P<0.001)。利用LM-EGD-e以MOI 200感染过表达PCCA蛋白的HeLa细胞,在感染后2 h、5 h和8 h分别收集感染细胞进行点样计数,结果显示,感染后各时间点PCCA蛋白过表达显著或极显著抑制LM-EGD-e的感染及其在胞内增殖的能力(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。综上所述,单增李斯特菌感染对宿主细胞内PCCA蛋白的表达无显著影响,但在宿主细胞中过表达PCCA会降低单增李斯特菌的胞内增殖能力。本研究首次探究了单增李斯特菌与宿主PCCA蛋白的调控关系,为深入探究单增李斯特菌等重要胞内菌的感染与宿主的内在联系机制,以及防控该病原感染奠定了基础。

小黑杨Rubisco小亚基基因启动子的克隆及表达活性分析

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用中决定碳同化速率的关键酶,其中小亚基(rbcS)是由核基因编码,并且主要在叶片中表达。利用RT-qPCR技术确定了小黑杨(Populus×xiaohei)叶片中高表达的Rubisco小亚基基因PxrbcS1和PxrbcS2基因,并克隆了其上游2 240、2 174 bp的启动子。对其进行启动子元件分析结果表明,PxrbcS1和PxrbcS2的启动子具有多个与光诱导表达相关的元件,例如G-box、MRE和Box4等元件。构建pBI-121-p PxrbcS1::GUS和pBI-121-p PxrbcS2::GUS植物表达载体并遗传转化84K杨(P. alba×P. glandulosa)。GUS组织化学染色以及qPCR表达分析表明PxrbcS1和PxrbcS2的启动子能够驱动GUS基因在84K杨叶片特异性高表达。总之,上述结果表明该研究成功地从小黑杨中克隆了具有叶片高表达活性的PxrbcS1和PxrbcS2的启动子,该启动子可应用到包括杨树在内的植物光合作用相关的基因功能研究以及提高植物光合作用的遗传操作中。