富血小板纤维蛋白对人牙槽骨骨髓间充质干细胞中Runx2、miR-17及BMP2表达的影响

目的:比较雌激素(estrogen,EST)和富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)对人牙槽骨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中Runt家族相关转录因子2(runt-related transcription factor2,Runx2)、微小RNA17(microRNA,miR-17)及骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达的影响。方法:在临床拔牙过程中收集牙槽窝内的骨屑,经酶消化法体外分离培养得BMSCs,并于显微镜下观察细胞的生长形态。实验分为3组,雌激素(estrogen,EST)处理组(EST组,浓度10-8 mol/L)、富血小板纤维蛋白治疗组(PRF组)及对照组(DMEM完全培养基组)。3组细胞经培养后采用MTT法检测细胞增殖率,采用酶标仪检测碱性磷酸酶活性,RT-qPCR检测Runx2、miR-17表达水平,Western blot法检测BMP2表达水平。结果:3组细胞培养7 d后细胞数量、碱性磷酸酶活性达到最高水平,随后增殖速率逐渐减慢,其中PRF组、EST组细胞于第3天开始细胞增殖速率均显著高于对照组(P<0.05)。培养7 d后,PRF组、EST组BMP-2及Runx2蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。BMSCs培养7 d后miR-17水平显著降低,而Runx2水平显著增加,其中PRF组、EST组在培养7 d时表达水平显著优于对照组(P<0.05)。结论:雌激素、富血小板纤维蛋白均可有效促进人牙槽骨BMSCs中Runx2、miR-17及BMP2的表达,从而有利于BMSCs的增殖、分化。

miR-17-5p通过调控PKD2对肺腺癌HCC827细胞生物学行为的影响

目的:探讨miR-17-5p在肺腺癌细胞中的表达及miR-17-5p对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡的影响及其分子作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR检测人肺腺癌细胞系HCC827和人正常肺上皮细胞BEAS-2B中miR-17-5p的表达水平。实验分为miR-17-5p过表达组(miR-17-5p mimics组)、miR-17-5p低表达组(miR-17-5p inhibitor组)和阴性对照组(NC组)。通过CCK-8、流式细胞术、Transwell实验探讨miR-17-5p对肺腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。最后通过Targetscan数据库预测出PKD2是miR-17-5p下游潜在的靶基因,利用实时荧光定量PCR和Western-blot实验验证miR-17-5p与PKD2之间的相互作用关系。结果:miR-17-5p在HCC827细胞中高表达(P<0.001),上调miR-17-5p后显著促进了肺腺癌细胞增殖(P<0.05)、侵袭(P<0.01)及迁移(P<0.05)并抑制凋亡(P<0.01)。miR-17-5p与PKD2的3’UTR存在直接结合位点,并且过表达miR-17-5p在mRNA和蛋白水平均显著促进了PKD2的表达(P<0.01)。结论:PKD2是miR-17-5p的直接靶基因,miR-17-5p通过调控PKD2影响肺腺癌细胞的生物学行为。

miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其对细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路的影响

目的:观察miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其对胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路的影响。方法:将大鼠随机数字法分为模型组、miR-17-5p mimics组、miR-17-5p inhibitor组。建模后,模型组经尾静脉注射10 mL/kg生理盐水,miR-17-5p mimics组、miR-17-5p inhibitor组分别经尾静脉注射7μL miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor与RNAi脂质体转染试剂的混合溶液。各组大鼠苏醒后的24 h进行神经功能评分,测定脑梗死体积、大鼠脑组织含水量,检测缺血侧大脑皮质细胞凋亡率,caspase-3、Bax、Bcl-2和ERK1/2蛋白表达。结果:miR-17-5p mimics组的神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑组织含水量、缺血侧大脑皮质细胞凋亡率明显低于模型组,miR-17-5p inhibitor组的神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑组织含水量、缺血侧大脑皮质细胞凋亡率显著高于其他2组;miR-17-5p mimics组大鼠缺血脑组织中caspase-3、Bax蛋白表达明显低于模型组,Bcl-2、p-ERK1/2蛋白表达高于模型组;miR-17-5p inhibitor组大鼠缺血脑组织中caspase-3、Bax、p-ERK1/2蛋白表达显著高于其他2组,Bcl-2蛋白表达低于其他2组。结论:miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的脑损伤具有一定的保护作用,miR-17-5p可抑制ERK1/2信号通路激活。

miR-889-3p靶向Runx2抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化

背景:研究表明miR-889-3p可参与调控多种细胞的增殖分化过程,但是其对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响尚不明确。目的:探讨miR-889-3p对脂肪间充质干细胞成骨分化的调节作用。方法:体外分离、培养SD大鼠脂肪间充质干细胞,转染miR-889-3p模拟物(miR-889-3p mimic)、miR-889-3p抑制剂(miR-889-3p inhibitor)和阴性对照(miR-NC)并诱导成骨分化。RT-PCR和Western blot检测成骨诱导14 d后的碱性磷酸酶活性、Runx2、骨钙素、骨桥素、Osterix等成骨相关mRNA和蛋白的表达。将野生型Runx2、突变型Runx2分别与miR-889-3p模拟物和miR-NC共转染脂肪间充质干细胞,通过双荧光素酶报告基因检测miR-889-3p与Runx2的靶向关系。结果与结论:①miR-889-3p表达水平随成骨诱导时间延长而逐渐减低;②成骨诱导第7天和第14天miR-889-3p inhibitor组的矿化结节数目、大小、颜色深浅明显超过miR-889-3p mimic组和miR-NC组(P<0.05);③miR-889-3p过表达后,碱性磷酸酶活性、Runx2、骨钙素、骨桥素、Osterix mRNA及蛋白表达量显著降低,而miR-889-3p敲除后成骨相关mRNA和蛋白表达量明显提高;④双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-889-3p过表达显著降低了野生型Runx2的荧光素酶活性;⑤上述结果表明,miR-889-3p通过靶向Runx2负向调控脂肪间充质干细胞成骨分化。

lncRNA HCG18/miR-17-5p/HMGA2分子轴调控非小细胞肺癌细胞增殖及迁移

目的:探讨lncRNA HCG18/miR-17-5p/HMGA2分子轴调控非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖及迁移的分子机制。方法:收集2017年6月至2018年6月承德市中心医院62例NSCLC组织及对应的癌旁组织标本,以及NSCLC细胞系A549、NCIH1299、H1650、NCI-H460和人肺上皮细胞BEAS-B,用qPCR法检测NSCLC组织及细胞系中HCG18、miR-17-5p及高迁移率族蛋白A2(HMGA2)的表达水平。分别用Si-HCG18、miR-17-5p、miR-17-5p+HCG18或pcDNA3.1-HMGA2转染A549和NCI-H460细胞,用CCK-8法、Transwell实验、Wb检测转染细胞的增殖、迁移、侵袭和HMGA2及EMT相关蛋白的表达。用双荧光素酶报告基因验证HCG18对miR-17-5p或miR-17-5p对HMGA2的靶向调控作用。构建敲降HCG18的A549细胞小鼠移植瘤模型,观察对移植瘤的影响。结果:lncRNA HCG18在NSCLC组织和细胞中均高表达(均P<0.01),发生淋巴结转移及晚期NSCLC患者中HCG18的表达显著提高,且HCG18高表达的NSCLC患者预后较差、生存率较低(均P<0.01)。转染Si-HCG18显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力(均P<0.01),上调上皮钙黏蛋白的表达(P<0.01)、下调神经钙黏蛋白和波形蛋白的表达(均P<0.01),小鼠移植瘤体积显著减小(P<0.05)。双荧光素酶报告基因验证了HCG18与miR-17-5p靶向结合,以及miR-17-5p与HMGA2靶向结合。转染miR-17-5p后NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭受到抑制(均P<0.01),促进上皮钙黏蛋白的表达(P<0.01)、抑制神经钙黏蛋白和波形蛋白的表达(均P<0.01),而转染miR-17-5p+HCG18后可抑制miR-17-5p的作用。结论:HCG18通过调控miR-17-5p/HMGA2分子轴促进NSCLC细胞的增殖及迁移。

膀胱移行细胞癌E2F3、miR-17-5p、miR-20a的表达及相关性分析

目的检测E2F3、miR-17-5p、miR-20a在膀胱癌中的表达情况,分析E2F3与miR-17-5p、miR-20a之间是否存在关联性。方法荧光定量RT-PCR法检测不同病理分级膀胱移行细胞癌组织和细胞系5637、T24中miR-17-5p、miR-20a和E2F3基因的表达,Western blot检测E2F3蛋白的表达。结果与正常膀胱黏膜比较,膀胱移行细胞癌组织及5637、T24细胞系中E2F3、miR-17-5p和miR-20a均高表达(P<0.05)。E2F3表达随着病理分级的升高逐步增多,miR-20a表达随病理分级的升高有降低趋势。5637细胞系相对T24细胞系高表达E2F3(P<0.05)。结论膀胱移行细胞癌中miR-17-5p、miR-20a和E2F3均高表达,miR-20a和miR-17-5p的表达与E2F3的增高密切相关。

miR-141及成骨基因Dlx5、Msx2、Runx2在去卵巢骨质疏松模型小鼠BMSCs成骨分化中的表达

目的:观察去卵巢骨质疏松模型组与假手术组小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中miR-141及成骨基因Dlx5、Msx2、Runx2的表达差异和变化趋势,探讨绝经后骨质疏松症的发生机制。方法:选用20只4周龄清洁级C57雌性小鼠,按照随机数字表法分为模型组和假手术组,每组各10只。模型组采用卵巢切除法建立小鼠绝经后骨质疏松症模型,假手术组保留卵巢,只切除卵巢周围脂肪。造模2个月后模型组小鼠经鉴定建模成功,此时采用全骨髓法分离培养2组小鼠BMSCs,进行细胞形态学观察,运用流式细胞技术进行细胞表型鉴定。对BMSCs成骨诱导分化,分别于第3天、8天、13天时采用碱性磷酸酶染色、定量和茜素红染色,观察BMSCs成骨能力。成骨诱导第3天、8天、13天时运用q-PCR检测miR-141及成骨基因Dlx5、Msx2、Runx2的表达,Western blot检测成骨基因蛋白的表达。结果:BMSCs经流式细胞表型鉴定CD29、CD44均阳性表达,CD34、CD45均阴性表达。2组BMSCs成骨诱导后,ALP表达量逐渐提高,第8天达到高峰,随后逐渐下降,呈"Λ"型变化;模型组较假手术组染色浅,活性检测结果与染色深浅程度一致。成骨诱导分化第3天、8天、13天时,模型组ALP表达量均低于假手术组(P<0.05),2组细胞进行茜素红染色,第8天时钙化结节出现,在第13天时,钙化结节数增多;成骨诱导第3天、第8天时,2组钙化结节数无明显差异,第13天时,与假手术组比较,模型组钙化结节数较少,成骨分化明显减缓。2组BMSCs成骨诱导后,成骨基因与蛋白的表达:成骨诱导第3天、8天、13天时,组内比较显示,Dlx5、Runx2表达均呈持续上升,miR-141、Msx2持续下降(P<0.05),与第3天时比较,第8天、13天的各项指标均有明显差异(P<0.05),组间比较显示,模型组miR-141、Msx2表达高于假手术组,Dlx5、Runx2表达低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:卵巢切除影响BMSCs的成骨分化;BMSCs成骨诱导分化中,miR-141、Msx2是成骨负性调节因子,Dlx5、Runx2是正性调节因子。

转染miR-17-5p对PC12细胞Bcl-2、Bax蛋白表达和形态学影响

目的:观察基因miR-17-5p转染对PC12细胞Bcl-2、Bax蛋白表达和形态学影响。方法:用质粒PEGFP-N1-vector空载体和PEGFP-N1-miR-17-5p表达载体转染正常的PC12细胞,将细胞分为对照组、空载组、miR-17-5p组。应用免疫细胞化学染色法和Western-blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达,电镜观察各组细胞超微结构改变。结果:对照组与空载组Bcl-2、Bax蛋白表达无显著性差异,miR-17-5p组与空载组比较,Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.01),而Bax蛋白表达明显增多(P<0.01),Western blot检测其凋亡相关蛋白表达变化与免疫组化结果一致。电镜下观察可见正常对照组与空载组细胞形态无明显差异,细胞形态结构正常,无明显病理改变;miR-17-5p转染组细胞胞体肿胀,线粒体髓样变和空泡样变,胞核扭曲凹陷,异染色质边集。结论:miR-17-5p基因过表达能引起PC12细胞促凋亡的Bax蛋白表达增多,抗凋亡的Bcl-2蛋白表达减少,导致PC12细胞形态学损伤。

miR-203靶向RUNX2对牙周膜干细胞成骨分化能力的调控作用

目的:体外研究miR-203对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响及调控机制。方法:分离培养人牙周膜干细胞,检测牙周膜干细胞矿化诱导前后miR-203和RUNX2的表达;分别转染miR-203沉默及过表达模拟物;qPCR检测miR-203和RUNX2 mRNA水平的表达;Western blot检测RUNX2蛋白水平的表达,茜素红染色观察细胞成骨分化能力的变化;生物信息学分析miR-203的靶基因,双荧光素酶报告实验验证;共转染miR-203 inhibitor和RUNX2 siRNA,分析共转染后对RUNX2表达及细胞成骨分化能力的影响。结果:成骨诱导液诱导后牙周膜干细胞中miR-203的表达水平显著下调,而RUNX2的表达水平明显升高;miR-203过表达可明显抑制h PDLSCs的成骨分化能力和RUNX2的表达,抑制miR-203的表达,则结果相反;通过生物信息学分析miR-203的潜在靶基因含有RUNX2,双荧光素酶报告实验验证RUNX2为miR-203的靶基因;进一步实验结果表明沉默RUNX2可逆转miR-203 inhibitor对牙周膜干细胞成骨分化的促进作用。结论:miR-203可靶向调控RUNX2对人牙周膜干细胞成骨分化能力产生影响,提示miR-203在h PDLSCs组织工程损伤修复过程中发挥着重要作用。

miR-30a-5p通过靶向Runx2基因抑制成骨细胞分化

目的:构建绝经后骨质疏松大鼠模型,分析miR-30a-5p在成骨细胞分化中的功能。方法:将SD大鼠分为雌激素组、假手术组和模型组;取胫骨组织进行miRNA测序并差异表达分析;检测miR-30a-5p在各组大鼠骨中的表达含量;通过qRT-PCR检测miR-30a-5p表达对成骨分化标记相关蛋白胶原Ⅰ、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)表达的影响,同时检测对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响;双萤光素酶报告基因检测miR-30a-5p对RUNT相关转录因子2(Runx2)的靶向调控作用。结果:miRNA测序分析结果显示,相对于假手术组、雌激素组,模型组有33种共同miRNA表达上调,选取miR-30a-5p作为本研究对象;qRT-PCR进一步验证miR-30a-5p在模型组骨组织中高表达;miR-30a-5p靶向抑制Runx2的表达,且能够抑制OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达,降低ALP活性;而同时过表达Runx2后,OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达升高,ALP活性增加,Runx2过表达部分缓解miR-30a-5p对成骨细胞分化的抑制作用。结论:miR-30a-5p在骨质疏松大鼠骨组织中表达上调,并能够靶向抑制Runx2的表达,从而抑制成骨细胞分化,促进骨质疏松进展,为骨质疏松症的诊断提供新的生物标志物。

miR-17靶向调控Akt2在抑制宫颈癌细胞增殖中的作用及机制研究

目的探讨miR-17在宫颈癌组织以及细胞株中的表达情况,验证miR-17与Akt2之间是否存在靶向调控关系,探讨miR-17靶向调控Akt2在宫颈癌细胞增殖中的作用及机制研究。方法采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测23例宫颈癌患者以及正常组织中miR-17的表达,同时检测2株宫颈癌细胞系(siHa、Hela)及1株正常宫颈上皮细胞H8中miR-17的表达。分别将miR-17抑制物、模拟物(mimics)和对照经脂质体转染Hela细胞48 h后,qRT-PCR检测转染效率,MTS法检测细胞增殖活力,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,western-blot检测转染后下游Foxo1A以及Bcl-2蛋白的表达情况。TargetScan软件预测结果表明Akt2为miR-17的靶基因,构建含有野生型或突变型Akt2基因3’-UTR区域的双荧光素酶报告基因载体,分别检测野生型或突变型Akt2基因与miR-17 mimics、抑制物以及vector共转染后对荧光素酶的活性影响。结果qRT-PCR结果显示miR-17在宫颈癌组织的表达显著高于癌旁正常组织,在宫颈癌细胞系中的表达水平亦显著高于正常宫颈上皮细胞。MTS以及平板克隆实验检测发现过表达miR-17后,Hela细胞的增殖以及克隆形成能力明显降低,细胞的凋亡率显著升高,western-blot实验检测发现Foxo1A以及Bcl-2蛋白的表达明显增加;抑制miR-17的表达后,细胞增殖以及克隆形成能力显著增强,细胞凋亡率明显降低,Foxo1A以及Bcl-2的表达降低。TargetScan软件预测结果表明Akt2为miR-17的直接靶基因,Akt2和miR-17 mimics共转染组较Akt2+miR-17抑制剂以及miR-17 vector共转染组的荧光素酶活性强度显著降低。结论miR-17可通过靶向调控Akt2进而调控Foxo1A和Bcl-2,抑制宫颈癌细胞的增殖。

MiR-17-5p在子宫内膜异位症间质细胞中的表达及其对基质金属蛋白酶-2的影响

目的:探讨miR-17-5p在子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)间质细胞中的表达及其对基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的影响。方法:MiRNA芯片筛选EMs异位子宫内膜组织中差异表达的miRNA,qRT-PCR验证EMs异位、在位子宫内膜组织和子宫肌瘤正常子宫内膜组织(对照组)中miR-17-5p的表达;提取以上各组组织中原代间质细胞,免疫荧光鉴定表面标志物;qRT-PCR和蛋白质印迹法检测各组间质细胞中miR-17-5p和MMP-2的表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-17-5p和MMP-2的靶向关系;EMs异位间质细胞中转染miR-17-5p mimic和inhibitor,qRT-PCR、蛋白质印迹法和明胶酶谱法检测MMP-2的表达,克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwel l实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力。结果:EMs异位子宫内膜组织中miR-17-5p、miR-200b、miR-106b、miR-15b、miR-141、miR-22显著下降,miR-202、miR-150、miR-365表达显著上升;与对照组相比,miR-17-5p在EMs异位、在位子宫内膜组织和间质细胞中表达均显著下降(P<0.05),而MMP-2在EMs异位、在位子宫内膜间质细胞中表达均显著升高(P<0.05);与阴性对照组(negative control,NC)相比,过表达miR-17-5p抑制MMP-2的表达并显著抑制细胞克隆形成数,细胞侵袭数及细胞迁移率(P<0.05),敲低miR-17-5p,结果相反。结论:MiR-17-5p在EMs间质细胞中表达下降,抑制miR-17-5p的表达能够促进MMP-2表达升高同时增强细胞增殖、侵袭和迁移能力。

鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区启动子活性鉴定与分析

文章采用基因定点突变和报告基因技术作A/T富集区启动子鉴定和转录调控分析,研究鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区是否具有启动子活性。PromPredict预测分析提示miR-17-92基因簇上游-388^-444 bp处可能是启动子区域。转录因子结合位点分析发现,A/T富集区存在3个E2F1潜在结合位点,分别位于miR-17-92基因簇上游-1 273 bp(结合位点1)、-1 186 bp(结合位点2)和-753 bp(结合位点3)处。报告基因活性分析发现,鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区具有启动子活性,其中miR-17-92基因簇上游-440/-1区域启动子活性最强。共转染分析显示,转录因子E2F1极显著抑制该A/T富集区启动子活性(P<0.01);进一步定点突变分析表明E2F1通过E2F1结合位点1和2抑制A/T富集区启动子活性。报告基因分析发现,与对A/T富集区启动子作用不同,E2F1促进miR-17-92基因簇宿主基因(MIR17HG)启动子活性。文章首次发现鸡miR-17-92基因簇上游存在一个新的转录调控区,对揭示鸡miR-17-92基因簇转录调控具有重要意义。

祛痰逐瘀方经miR-628/Pten/Runx2调控酒精性股骨头坏死骨稳态代谢机制研究

目的探究祛痰逐瘀方(QZD)经特异性miRNA调控酒精性股骨头坏死(AIONFH)内骨稳态代谢机制的作用及对坏死骨修复的影响。方法采集34例AIONFH患者(AIONFH组)和34例相对健康组的血清样本,应用miRCURY LNA^(TM) Universal RT microRNA PCR Panels提取获得高差异表达miRNA,并进行生物信息学分析;采集服用QZD的AIONFH患者(中药治疗组,n=8)、未服用药物患者及相对健康人群血清样本进行RT-qPCR验证,获得特异性miRNA表达。SPF级雄性大鼠随机均分为正常对照组(正常组)、酒精组(模型组)、酒精+QZD组(实验组);分别对股骨近端松质骨进行Micro-CT检查;组织进行HE染色、甲苯蓝染色和Trap染色检测;RT-qPCR测定特异性miRNA、Runx2、Pten表达。结果 (1)microRNA PCR Panels结果提示miR-628在AIONFH组中低表达,并经预测与骨稳态靶基因Pten和Runx2相关;(2)经QZD干预后中药治疗组血清内miR-628较未干预的AIONFH组升高;(3)经HE染色中,实验组可见骨小梁密度较模型组高、骨小梁形态改善;甲苯胺蓝染色提示,实验组形成的成骨细胞密度均显著高于模型组;Trap染色提示与模型组相比,QZD对破骨细胞分化有抑制作用;(4)在Micro-CT中实验组与模型组相比,前者BV/TV、Tb.Th、Tb/N等值升高(P<0.05);(5)RT-qPCR检测提示实验组miR-628、Pten和Runx2表达量均较模型组升高。结论 QZD经特异性miR-628/Pten/Runx2调控AIONFH内骨稳态代谢机制的作用,从而促进坏死修复。

鸡miR-17-92基因簇靶基因ZFPM2的鉴定及功能分析

miR-17-92基因簇在哺乳动物的许多生理和病理过程中发挥重要作用。本实验室前期研究发现,miR-17-92基因簇促进鸡前脂肪细胞的增殖,但其作用机制尚不清楚。为了揭示miR-17-92基因簇促进鸡前脂肪细胞增殖的作用机制,本研究采用CCK-8细胞增殖检测方法分析干扰ZFPM2对前脂肪细胞的影响,结果发现,干扰ZFPM2能显著促进鸡前脂肪细胞的增殖(P<0.01);与CCK-8分析结果相一致,干扰ZFPM2可致使细胞增殖标志基因PCNA、Ki67、Cyclin D1的mRNA表达量明显升高(P<0.01或P<0.05)。进一步对鸡ZFPM2基因进行生物信息学分析,发现该基因mRNA的3′UTR有两个区域存在miR-17-92基因簇4个成员(miR-17-5p、miR-20a、miR-19a及miR-19b)的潜在结合位点。为验证miR-17-92基因簇是否靶作用于鸡ZFPM2基因,构建了鸡ZFPM2基因3′UTR区的荧光素酶报告基因载体(野生型)(psi-CHECK2-ZFPM2-3′UTR-WT)及其突变型的荧光素酶报告基因载体(psi-CHECK2-ZFPM2-3′UTR-MUT)。报告基因活性分析显示,过表达mi-17-92基因簇能极显著地抑制野生型ZFPM2的报告基因活性(P<0.01);转染miR-17-5p、miR-20a及miR-19a的抑制剂均能显著地提高野生型ZFPM2报告基因的活性(P<0.01或P<0.05),但这些抑制剂对突变型ZFPM2报告基因的活性无明显影响。q RT-PCR分析发现,miR-17-5p、miR-19a及miR-20a的抑制剂能显著提高内源性ZFPM2基因mRNA的表达水平(P<0.01或P<0.05)。共转染分析发现,尽管差异不显著,但miR-17-5p和miR-19a的抑制剂均倾向于降低ZFPM2干扰片段的促细胞增殖作用。本研究结果表明:miR-17-92基因簇成员miR-17-5p、miR-20a、miR-19a及miR-19b靶作用于ZFPM2;miR-17-92基因簇至少部分通过抑制ZFPM2基因表达从而促进鸡前脂肪细胞的增殖。

miR-376b-3p可促进Runx2诱导C2C12细胞进行成骨细胞早期分化

背景:转录因子Runx2是调节成骨分化及骨发育的关键因子,过表达Runx2可诱导间质细胞C2C12分化为成骨细胞,但相关诱导分化分子机制并不清楚。目的:分析miR-376家族成员在Runx2诱导C2C12细胞进行成骨分化过程中的作用。方法:利用可诱导表达Runx2的细胞系C2C12/Runx2Dox,在不同的时间点通过荧光定量PCR方法检测miR-376家族成员表达情况。C2C12/Runx2Dox细胞转染miR-376b-3p mimic后利用荧光定量PCR检测成骨细胞标记基因碱性磷酸酶及骨钙素表达情况,并利用碱性磷酸酶染色法分析碱性磷酸酶活性。利用在线工具miRanda,miRWalk与TargetScan共同预测miR-376b-3p潜在靶基因。利用DAVID Bioinformatics Resources数据库对得到的靶基因进行功能聚类分析。结果与结论:在Runx2诱导C2C12进行成骨分化过程中miR-376b-3p表达显著增加,其他成员表达无明显变化。转染miR-376b-3pmimic可上调碱性磷酸酶表达,但对骨钙素表达无影响;转染miR-376b-3pmimic也可增加碱性磷酸酶活性。靶基因功能聚类分析结果表明miR-376b-3p可参与机体骨骼发育过程,表明其在成骨分化过程中的作用。研究结果表明,Runx2通过上调miR-376b-3p的方式对与成骨分化相关基因的表达进行调节,以促进C2C12进行成骨细胞的早期分化。

非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b变化及其临床意义

目的探讨非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)合并2型糖尿病(T2DM)患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b变化及其临床意义。方法2018年12月~2020年6月我院收治的T2DM患者46例和NAFLD合并T2DM患者50例(轻度19例、中度17例和重度14例)。采用实时荧光定量RT-PCR法检测血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平。采用多因素Logistic回归分析NAFLD合并T2DM发生的独立危险因素,应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析各指标诊断严重NAFLD的效能。结果NAFLD合并T2DM患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平分别为(5.6±1.3)、(3.8±0.9)和(1.8±0.5),显著高于T2DM患者【分别为(4.4±1.1)、(3.1±0.6)和(1.4±0.4),P<0.05】;重度NAFLD组血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平分别为(6.0±1.1)、(4.0±0.8)和(1.9±0.5),显著高于中度患者【分别为(4.4±1.0)、(3.4±0.6)和(1.5±0.4),P<0.05】或轻度患者【分别为(4.1±0.6)、(2.8±0.8)和(1.2±0.3),P<0.05】;多因素Logistic回归分析显示,BMI、血清LDL-C、miR-17、miR-20a和miR-20b是NAFLD合并T2DM发生的独立危险因素(P<0.05);ROC分析结果显示,血清miR-17、miR-20a和miR-20b诊断严重NAFLD的AUC分别为0.75、0.74和0.70。结论NAFLD合并T2DM患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b水平显著升高,可能参与了NAFLD的发病过程,对判断NAFLD的严重程度具有一定的意义。

miR-17-5p和MMP2在百草枯致肺上皮-间质转化中的机制研究

目的揭示miR-17-5p和MMP2在百草枯(Paraquat,PQ)中毒所致的肺上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用。方法构建PQ中毒致肺EMT的细胞模型(A549细胞),经15、30、60μmol/L的PQ染毒6 d,采用Western blot或qRT-PCR检测模型中EMT相关基因E-钙黏附蛋白(Epithelia cadherin,E-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况。采用Western blot或qRT-PCR检测模型中基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP2)、miR-17-5p的表达情况,通过转染miR-17-5p的类似物(mimic)或抑制剂(inhibitor)来研究miR-17-5p对MMP2的调控作用。结果Western blot结果显示,E-cadherin在30μmol/L PQ染毒组表达下调(P=0.018),在60μmol/L PQ染毒组下调更明显(P=0.009);α-SMA在30μmol/L PQ染毒组α-SMA表达上调(P=0.037),在60μmol/L PQ染毒组上调更明显(P=0.008);MMP2在30μmol/L PQ染毒组MMP2表达上调(P=0.016),在60μmol/L PQ染毒组上调更明显(P=0.007)。qRT-PCR结果显示,E-cadherin在30μmol/L PQ染毒组表达下调(P=0.010),在60μmol/L PQ染毒组下调更明显(P<0.001);α-SMA在30μmol/L PQ染毒组表达上调(P=0.003),在60μmol/L PQ染毒组上调更明显(P<0.001);MMP2在30μmol/L PQ染毒组表达上调(P=0.004),在60μmol/L PQ染毒组上调更明显(P=0.002)。qRT-PCR结果提示,30μmol/L PQ染毒组miR-17-5p表达下调(P=0.010),60μmol/L PQ染毒组miR-17-5p表达下调更明显(P=0.001)。mimic作用后MMP2表达下调(P=0.002),而inhibitor作用后MMP2表达上调(P=0.005)。结论MMP2可作为miR-17-5p靶基因,其表达受miR-17-5p调控,其相互作用参与PQ致肺EMT的过程中。

张应变调控的circ-Plscr2/miR-17-92/Lamtor1通路在静脉移植血管重建中的力学生物学作用

目的临床上常用自体静脉血管作为冠状动脉旁路移植术的供体,然而动脉力学环境诱导移植后静脉内膜异常增生可能引起术后血管再狭窄甚至阻塞病变。本研究旨在探讨张应变通过内源性竞争机制(ceRNA)调控Lamtor1的表达从而影响静脉平滑肌细胞(venous smooth muscle cells,VSMCs)功能的机制。方法应用'套管法'构建大鼠静脉移植模型;FX5 000张应变加载系统对体外培养VSMCs施加10%张应变模拟移植静脉中VSMCs受到的张应变力学刺激。生物信息学方法预测与circRNA结合miRNA位点;RT-qPCR法验证移植静脉中circRNA miRNA cluster的变化;RNA干circRNA Lamtor1后检测其对VSMCs的增殖及分化的影响。结果 RN A-seq及qPCR验证结果表明,移植静脉中circRNA Plscr2表达显著升高。生物信息学预测与circ-Plscr2结合的miRNAs,通过miRNA芯片检测移植静脉中差异表达的miR-17-92及miR-29 cluster,TargetScan预测其共同的靶分子是Lamtor1。移植静脉中Lamtor1表达水平显著性上升,并且激活下游mTOR和p-mTOR的表达,进而磷酸化4EBP1及S6K。细胞张应变加载实验结果表明,张应变显著上调circ-Plscr2表达,下调miR-17-92及miR-29cluster,同时Lamor1表达显著上调,其下游p-mTOR/mTOR信号通路被激活。siRNA干扰circ-Plscr2后VSMCs增殖与迁移受到抑制,表型分化指标均升高;siRNA干扰Lamtor1后显著抑制VSMCs增殖能力并促进VSMCs向收缩表型转化。结论周期性张应变可能通过circ-Plscr2/miR-17-92/Lamtor1通路,激活下游mTOR信号通路参与调控VSMCs功能。

miR-17-92和p21对E2F-Rb网络动力学的影响

转录因子E2F对于细胞周期进程具有重要的作用,它调控着细胞的增殖和凋亡。而p21和miR-17-92都是细胞周期进程的有效抑制剂。为了进一步探究p21和miR-17-92对于E2F的调控机制,提出了E2F/Myc/miR-17-92/p21网络模型。通过数值模拟发现miR-17-92、p21可调控E2F的开关转换值和跳跃的幅度,还可以引导细胞进出癌区且miR-17-92和p21的共同调控比起各自调控更有效。这很可能为癌症的治疗提供新思路。