结核分枝杆菌rv0394c基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其粘附特性的鉴定

本实验室前期研究鉴定出结核分枝杆菌的rv0394c基因产物具有透明质酸酶的活性,但对于该酶在分枝杆菌致病中的作用尚不清楚。为了鉴定该蛋白对细胞是否具有粘附特性,本研究利用大肠杆菌表达纯化的重组蛋白RV0394c与人肺泡上皮细胞(A549细胞)互作,通过激光共聚焦显微镜观察到蛋白对细胞的特异性粘附。为进一步验证该试验结果,将rv0394c基因克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒p MV262中,将重组质粒电转化于非致病性的耻垢分枝杆菌中进行表达。构建的重组菌与A549细胞进行互作,结果表明重组菌可以粘附于A549细胞表面,而且这种粘附能够被RV0394c重组蛋白所阻断,这些结果表明RV0394c蛋白具有粘附细胞的能力,属于该菌的粘附蛋白之一。RV0394c蛋白粘附特性的鉴定为进一步研究该蛋白在致病性中的作用提供了实验依据。

结核分枝杆菌黏附蛋白Rv0394c的结晶及其对分枝杆菌致病性的影响

为了研究结核分枝杆菌黏附蛋白Rv0394c的结构、黏附途径及其在分枝杆菌致病过程中的作用,试验通过亲和层析法纯化Rv0394c蛋白,然后使用蛋白结晶筛选试剂盒筛选蛋白质结晶条件,通过亚细胞定位确定Rv0394c蛋白在分枝杆菌中的定位;通过激光共聚焦显微镜观察Rv0394c蛋白与A549细胞的黏附情况;随后进行重组耻垢分枝杆菌(Rv0394c_Ms和pMV262_Ms)与A549细胞的黏附和黏附阻断试验并计数肺脏荷菌数;用重组耻垢分枝杆菌(Rv0394c_Ms和pMV262_Ms)滴鼻感染小鼠,在不同感染时间分别摘取肺脏观察病理变化并进行荷菌数计数。结果表明:成功获得Rv0394c蛋白。Rv0394c蛋白浓度为8 mg/mL时,在0.15 mol/L二水氯化钙-0.1 mol/L三水醋酸钠-pH值为4.6-15%异丙醇条件下,Rv0394c蛋白出现单晶生长。Rv0394c蛋白为胞外蛋白且能通过透明质酸(HA)黏附于A549细胞表面;与pMV262_Ms相比,Rv0394c_Ms黏附于A549细胞的数量极显著增加(P<0.01),用Rv0394c蛋白、HA和兔抗Rv0394c多克隆抗体处理的Rv0394c_Ms在A549细胞中的荷菌数极显著高于Rv0394c_Ms在A549细胞中的荷菌数(P<0.01)。在感染小鼠第4,8,14天,Rv0394c_Ms组在肺脏中的荷菌数极显著高于pMV262_Ms组(P<0.01);在第8天,Rv0394c_Ms组荷菌数极显著高于Rv0394c_Ms+HA组(P<0.01)。Rv0394c蛋白能诱导小鼠肺脏的病理损伤。说明黏附蛋白Rv0394c是通过透明质酸黏附于肺脏上皮细胞参与分枝杆菌致病过程的。