采用基因打靶技术构建结核分枝杆菌新基因Rv0901缺失株的研究

目的 :利用基因打靶技术构建基因打靶载体和基因缺失株 ,用于结核分枝杆菌基因Rv0 90 1功能的研究。方法 :结核分枝杆菌标准株H37Rv体外培养 ,对其Rv0 90 1基因及两侧序列进行体外扩增 ,连接载体及目的片段 ,切除目的基因 ,再引入筛选标志构建重组自杀质粒 ,分别用酶切及PCR鉴定 ;用电穿孔法将重组自杀质粒转入结核杆菌H37Rv株 ,用PCR鉴定。结果 :经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符 ,且为所需目的基因片段 ,成功切除靶片段 ;蓝白斑筛选证实标记基因插入片段插入方向正确 ;Rv0 90 1基因缺失株用PCR鉴定成功缺失了目的基因片段 2 5kb。结论 :成功构建了用于结核分枝杆菌基因打靶的置换型载体和Rv0 90 1新基因缺失株 ,为Rv0 90

结核分支杆菌Rv0901基因置换型打靶载体的构建

目的 :对结核杆菌H3 7Rv的Rv0 90 1基因进行体外扩增 ,构建基因打靶载体 ,利用基因打靶技术进行结核分支杆菌基因Rv0 90 1功能的研究。方法 :结核分支杆菌标准毒力株H3 7Rv体外培养 ,扩增目的基因 ,连接载体及目的片段 ,切除目的基因 ,筛选阳性克隆 ,酶切鉴定。结果 :经酶切鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符 ,鉴定证实PCR产物及插入片段为所需目的基因片段 ,成功切除靶片段。证实标记基因插入片段插入方向正确。结论 :成功构建了用于结核分支杆菌基因打靶的置换型载体 ,为随后将进行的Rv0 90 1基因敲除株的建立 ,Rv0 90 1基因功能的研究奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其细胞作用

目的 对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究。方法 以PCR扩增Rv0901基因编码序列，定向克隆人穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒，将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌，构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌，对重组耻垢分枝杆菌进行诱导表达，用SDS-PAGE检测表达结果。比较耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌对THP-1细胞的不同作用。结果 成功构建重组穿梭表达质粒及重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌，重组菌诱导THP-1细胞的凋亡率高于耻垢分枝杆菌，其感染THP-1细胞后细胞的存活率低于耻垢分枝杆菌的感染，重组菌感染THP-1细胞后细胞培养液中NO（一氧化氮）的产生高于耻垢分枝杆菌的感染。结论 Rv0901基因可能与结核毒力存在一定关系。