结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的构建结核分枝杆菌rv1837c、rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性。方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv rv1837c、rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体。然后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经0.4mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导;分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。经镍离子螯和氮川乙酸-组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,取兔血清与纯化蛋白通过Western blot方法,检测家兔血清中的抗体。结果pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30%及50%。获得纯度为90%的重组蛋白。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的构建结核分枝杆菌rv1837c．rv3803c基因原核表达重组质粒，进行表达、纯化，并分析其免疫原性。方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rvrv1837c．rv3803c基因，并克隆入pTA2质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体。然后转化人表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），经0．4mmol／L异丙基硫代-β—D-半乳糖苷诱导1分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western—blot，鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。经镍离子螯和氮川乙酸一组氨酸标签亲和树脂纯化，将纯化的重组蛋白分别免疫家免，取兔血清与纯化蛋白通过Western-blot方法，检测家兔血清中的抗体。结果pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白，表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量分别占全菌蛋白质的30％及50％。获得纯度为90％的重组蛋白。纯化蛋白通过Western-blot鉴定证实为目的蛋白，有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a（＋）：rv1837c,pET30a（＋）：rv3803c，并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白，为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。

结核分枝杆菌GLCB蛋白的生物信息学分析

目的对结核分枝杆菌Rv1837c基因编码蛋白GLCB的结构和功能进行生物信息学分析和预测。方法自GenBank数据库中获取Rv1837c全部基因信息,运用ProtParam及ProtScale分别预测其编码的glcB蛋白理化性质和亲疏水性;使用SignalP,NetPhos和TMHMM分析glcB的信号肽、磷酸化位点、跨膜螺旋;分别利用SOPMA,SWISSMODEL分析glcB蛋白的二级结构并建立三级结构模型;利用Vaxijen v2.0进行抗原性分析并用ABCpred预测glcB蛋白的B细胞抗原表位。结果Rv1837c基因全长2226bp,其编码的glcB蛋白含有741个氨基酸残基,疏水系数-0.1545,为亲水性蛋白,不稳定指数为33.81,定义其为稳定蛋白。glcB蛋白无信号肽和跨膜蛋白,含有大量磷酸化位点及B细胞抗原表位。结论生物信息学分析glcB蛋白为亲水性蛋白,具有潜在多个抗原表位,可作为结核病疫苗研发的候选蛋白。