结核分枝杆菌Rv3048c基因及编码蛋白生物信息学分析与制备

目的探究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)Rv3048c基因编码蛋白成为结核病临床检测标志物及蛋白疫苗的可能性,为结核病防控提供新的实验数据。方法通过生物信息学方法分析、预测该基因及其编码蛋白的基本生物学性质;在NCBI数据库检索Rv3048c基因及编码蛋白序列,设计并合成Rv3048c基因的引物,以热灭活Mtb基因组DNA为模板,经聚合酶链式反应获得该基因并将其构建到pET28a表达载体,构建pET28a-Rv3048c重组质粒;应用热激法将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建pET28a-Rv3048c-BL21(DE3)表达菌株;以IPTG为诱导剂获得Rv3048c基因编码的重组蛋白;最后,用镍金属螯合层析纯化获得高纯度重组蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot验证该重组蛋白。结果Rv3048c基因编码蛋白NrdF2由324个氨基酸组成,含两个α亚基和两个β亚基。该蛋白是亲水性、无跨膜结构域、无信号肽的细胞内蛋白;该蛋白理论分子质量为36.99153 ku,等电点为4.57,有36个磷酸化位点。基于ABCpred预测出5个B细胞表位。SYFPEITHI预测出CTL细胞表位和Th细胞表位共有9个。重组质粒Pet28a-Rv3048c在表达宿主E.coli BL21(DE3)中为可溶性表达;SDS-PAGE和小鼠抗His-Tag抗体免疫印迹(Western blot,WB)证实重组质粒pET28a-Rv3048c在E.coli BL21(DE3)中成功表达。结论Rv3048c基因编码蛋白nrdF2中存在多个位点和抗原表位,是潜在的结核病检测血清标志物。本研究获得该重组蛋白,为进一步评估其免疫原性与结核病血清学检测提供实验支持。

不同佐剂组合对结核分枝杆菌四种蛋白的免疫原性影响

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)因其免疫记忆减弱,对于成人结核病的预防效果较差,通过使用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原构建结核亚单位疫苗可进一步增强免疫保护作用。本研究选用了MTB不同结构组分中的四种蛋白Rv0577、Rv2831、Rv3048c、Rv3872,并分别在原核表达体系中实现蛋白的可溶性表达,经亲和色谱纯化可得到高纯度的目的蛋白。以不同的佐剂组合与纯化的结核蛋白混合后免疫BALB/c小鼠,收集血清后用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测体液免疫效果。结果表明,以胞嘧啶—鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(cytosine phosphoguanine oligonucleotide,CpG)和铝(aluminiumhydroxide,Al)作为佐剂,能显著提高免疫原性较弱的Rv0577、Rv3048c和Rv3872的IgG效价,对免疫原性较强的Rv3872的抗体滴度无显著影响,并且佐剂的使用对小鼠体重无改变。这表明CpG和Al的联合应用可提高弱免疫原性结核蛋白的免疫应答且无明显毒副作用,可作为结核亚单位疫苗的一种有效佐剂配方。