结核分枝杆菌Rv3407蛋白抗原表位的预测

目的预测结核分枝杆菌Rv3407的抗原表位。方法利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3407氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性、柔韧性等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位。结果 Rv3407蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,潜在的B细胞抗原表位较少,可能位于11-26、28-43、50-61、66-74、76-99位氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。该蛋白潜在的T细胞抗原表位较多,可能位于2-12、22-26、34-37、40-44、56-60、75-79、86-93位氨基酸残基或其附近。结论结核分枝杆菌Rv3407是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原,B细胞抗原表位略少,预测结果为该蛋白抗原表位的进一步研究与应用奠定了基础。

结核潜伏感染相关蛋白Rv3407结构和功能的生物信息学分析

目的应用生物信息学方法预测分析结核潜伏感染相关蛋白Rv3407的结构及功能。方法从NCBI数据库中搜索结核分枝杆菌Rv3407蛋白的氨基酸序列,分别利用ProtParam、Protscale、TMHMM、PSORT、SignalP、ITASSER、NetNGlyc、NetPhos、Motif Scan、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析蛋白质的理化性质、亲(疏)水性、跨膜螺旋、亚细胞定位、信号肽,可能与之结合的配体和该配体的结合位点、糖基化、磷酸化和翻译后修饰位点及二、三级结构;采用BepiPred、ABCpred、IEDB预测分析B细胞表位,采用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC、NetCTL预测分析细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,采用SYFPEITHI和RANKPEP预测分析辅助性T(Th)淋巴细胞表位。结果 Rv3407蛋白共由99个氨基酸构成,分子式为C471H807N155O144S2,不稳定指数为46.59,为亲水性不稳定蛋白;无跨膜螺旋区及信号肽,细胞内定位为胞浆蛋白;可能与之结合的配体有4个;无糖基化位点;苏氨酸、丝氨酸磷酸化位点分别有2和4个;酰胺化、cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化、蛋白激酶C磷酸化、N-豆蔻酰化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化的位点各1个;其二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲分别占45.45%、11.11%、8.08%及35.35%;B细胞表位可能分布于28-36、50-54、68-71、78-86、96-99位氨基酸残基或其附近;CTL表位可能分布于57-65,40-48,87-95位氨基酸残基或其附近;Th表位主要集中分布于2-39、45-63、71-85位氨基酸残基或其附近。结论结核潜伏感染相关蛋白Rv3407存在多个潜在的B细胞及T细胞抗原表位,其中以T细胞抗原表位占优势,免疫原性良好,可为结核潜伏感染疫苗的研制、免疫学诊断等提供理论依据。

结核DNA疫苗质粒pVAX1-Rv3407的构建及体外表达

目的构建结核DNA疫苗质粒pVAX1-Rv3407,并检测其在哺乳动物细胞293T中的表达。方法以基因重组卡介苗(rBCG)AERAS-422基因组为模板,PCR扩增Rv3407基因,构建真核表达质粒pVAX1-Rv3407,转染293T细胞,采用免疫荧光法及Western blot法检测Rv3407蛋白的表达。结果 PCR扩增获得长300 bp的Rv3407基因片段;重组真核表达质粒pVAX1-Rv3407经双酶切及DNA测序证明构建正确;转染48 h后,Rv3407蛋白在293T细胞中有效表达,且主要分布在细胞质中。结论成功构建了结核DNA疫苗质粒pVAX1-Rv3407,为新型结核病疫苗的研制奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B+Rv3407融合基因自杀性DNA疫苗的构建及鉴定

目的构建表达结核分枝杆菌生长期抗原Ag85B和休眠期蛋白Rv3407的自杀性DNA疫苗融合基因表达载体,并检测其在BHK-21细胞中的表达。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85B基因和Rv3407蛋白基因,再以二者的混合物为模板扩增Ag85B+Rv3407融合基因,构建真核表达载体pSCA1/Ag85B+Rv3407,以ELISA法检测其在BHK-21细胞中的瞬时表达。结果从结核分枝杆菌基因组中扩增得到Ag85B+Rv3407融合基因,片段大小为1 323bp,与预期相符。成功构建重组质粒pSCA1/Ag85B+Rv3407,该重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的蛋白(实验组P/N≥2.1)。结论成功构建结核分枝杆菌自杀性DNA疫苗融合基因表达载体,该重新载体能在真核细胞中表达目的蛋白。