sRNA RybB缺失后沙门氏菌的转录组分析

为了探明沙门氏菌在sRNA RybB缺失后的转录组变化情况,试验对沙门氏菌LT2菌株和RybB基因缺失株进行高通量测序,运用DESeq2算法筛选sRNA RybB缺失后的差异表达基因,并对其进行GO功能注释、KEGG信号通路富集分析及EggNOG功能注释,并利用实时荧光定量PCR验证筛选出的10个差异表达基因结果的可靠性。结果表明:共筛选出199个差异表达基因,其中上调基因98个,下调基因101个。差异表达基因GO功能主要注释了酰胺转运、肽转运、大分子蛋白定位等生物学过程,参与了鞭毛组装、双组分系统、沙门氏菌感染、丙酸代谢和NOD样受体信号通路等27个KEGG信号通路,EggNOG功能注释了细胞壁/膜/包膜生物发生、一般功能预测、碳水化合物运输与代谢、氨基酸的转运和代谢等蛋白分类。差异表达基因STM1049、STM1246、STM4504、STM1394、STM1050、STM3600、STM3599、STM3601、STM3598和STM3602的相对表达量与转录组测序结果的变化趋势一致。说明sRNA RybB缺失后会影响细菌的生命活动,以及可直接或间接调节沙门氏菌的各种代谢途径。

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示:成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调(P<0.01),具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调(P<0.01),具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活疫苗与新型抗菌药物研制的研究奠定基础。

沙门菌伴侣蛋白Hfq及RybB对外膜蛋白相关基因fadL、ompN、ybfM的作用

为了解RybB sRNA、RNA伴侣蛋白Hfq对沙门菌外膜蛋白fadL、ybfM、ompN的作用,利用λ-red同源重组系统构建fadL、ybfM、ompN基因lac融合菌株,通过P22噬菌体转导完成颜色指示菌株中RybB、hfq基因的单缺失与双缺失,进行β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR,对其相应表达量进行分析.结果表明,Hfq抑制ybfM、ompN的表达,但fadL的表达上调;RybB sRNA抑制ompN、fadL的表达,但ybfM的表达上调.当Hfq与RybB共同对ybfM、fadL、ompN进行调控时,对ompN、ybfM的表达具有抑制作用,但fadL的表达上调,且Hfq的调控作用总体大于RybB.

鼠伤寒沙门菌小RNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD的表达调控

【目的】探究小RNA(small RNA,sRNA)RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpD表达的调控作用。【方法】以鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium,STM)为研究对象,将含有编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的pCE40质粒转入ompD基因单缺失菌株中以获得lacZ报告菌株;在此基础上,利用P22噬菌体转导技术分在lacZ报告菌株中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短以获得双突变实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。通过β-半乳糖苷酶活性试验和RT-qPCR探究sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpD表达的调控作用。【结果】成功在lacZ报告菌中构建rybB全序列缺失、hfq全序列缺失、hfq点序列敲除和hfq序列截短等双缺失实验菌株,以及rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株。与野生型(wild type,WT)菌株相比,在lacZ报告菌株中,hfq基因截短为87个氨基酸序列的突变株中的OmpD蛋白活性下调了2.16%,其余实验株OmpD蛋白的β-半乳糖苷酶活性均呈上升趋势。与WT菌株相比,实验菌株ompD基因转录水平除了STM LT2ΔompD::lacZΔhfq65的上调不具有显著性外,其余实验菌株均显著(P<0.05)上调,其中lacZ报告菌株、rybB全序列缺失和hfq全序列缺失的三突变实验菌株ompD基因转录水平上调最明显,为1.83倍。【结论】ompD基因的转录及蛋白表达主要受hfq基因和sRNA RybB的负反馈调节;Hfq的远端面在对ompD基因的转录抑制中起关键作用。通过多个基因突变菌株的构建,阐述了sRNA伴侣蛋白Hfq与孔蛋白OmpD的相互作用关系,探索了Hfq对ompD的调控关键区域,丰富了sRNA的调控理论。

沙门菌外膜蛋白相关基因缺失株的致病性

为探究沙门菌外膜蛋白基因fadL、ompN、ybfM以及sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq缺失对该菌致病性的影响,构建了鼠伤寒沙门菌基因缺失菌株,并测定了基因缺失菌株的生长曲线,同时通过小鼠腹腔注射测定了基因缺失菌株的毒力及其在小鼠脾脏和肝脏上的定殖能力.结果显示,与鼠伤寒沙门菌亲本野生型菌株LT2相比,基因缺失菌株的生长能力变化不大.LT2对小鼠的LD_(50)为3.97×10^(7)CFU;外膜蛋白基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL和ΔybfM的LD_(50)分别为1.58×10^(5)、6.29×10^(5)、9.97×10^(5)CFU,毒性明显增强;sRNA敲除菌株(ΔrybB)的LD_(50)为9.97×10^(7)CFU,毒性有所下降;伴侣蛋白Hfq敲除组(Δhfq)及rybB&hfq双敲除组的小鼠死亡数未超过50%,毒性明显下降.感染48 h后,与对照组(LT2)相比,所有基因缺失菌株处理组的脾脏指数均极显著性升高;ΔrybB&Δhfq、Δhfq处理组的脾脏载菌量显著降低,其余菌株处理组的载菌量与LT2差异不显著;ΔrybB、ΔrybB&Δhfq、ΔfadL、ΔybfM处理组的肝脏指数均显著下降,而Δhfq、ΔompN处理组的肝脏指数变化不显著;ΔrybB、ΔfadL处理组肝脏载菌量变化不显著,Δhfq、ΔrybB&Δhfq处理组的肝脏载菌量显著下降,而ΔompN、ΔybfM处理组的载菌量显著上升.总的来说,hfq、rybB缺失降低了鼠伤寒沙门菌的致病力,而fadL、ompN、ybfM的缺失提高了鼠伤寒沙门菌的致病力.