非编码小RNA(RyhB)调控禽致病性大肠杆菌毒力相关基因的分析

以小RNA(RyhB)为研究对象,探索RyhB对禽致病性大肠杆菌相关毒力基因的调控研究。采用Red同源重组技术构建APEC野生株(AE17)RyhB的缺失株△RyhB以及构建出回复株△RyhB-comp。运用活菌计数法分别观察AE17、△RyhB、△RyhB-comp黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力,并且利用Real-time PCR检测AE17、△RyhB和△RyhB-comp的8个毒力基因转录水平。结果成功构建出了基因缺失株△RyhB和回复株△RyhBcomp,△RyhB黏附细胞能力较AE17均有显著地降低,约为AE17的62.5%,△RyhB-comp较△RyhB黏附能力显著上升,为△RyhB的1.4倍。同时,Real-time PCR结果显示,△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的转录水平均极显著下降(P<0.01),其mRNA转录水平分别约为AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%;△RyhB的iss、ibeA毒力基因表达水平分别上调约1.14倍和1.2倍。表明RyhB的缺失能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使毒力基因的转录水平有所降低。根据以上结果,推测RyhB对APEC的毒力具有极其重要的调节作用。

RyhB-cysE基因对禽致病性大肠杆菌生物表型的影响

在禽致病性大肠杆菌(APEC)AE17及AE17△RyhB的基础上利用Red同源重组技术构建基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE,对野生株和基因缺失株的生长、生物被膜形成和运动特性进行分析,并采用qRT-PCR技术比较野生株和缺失株中与运动性、生物被膜形成相关基因的转录水平。结果显示,各菌株生长曲线无显著差异;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力较AE17显著下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE运动能力与AE17相比下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比flhB、flgD、fliF和cheY转录水平均降低,而AE17△RyhB△cysE与AE17△cysE相比基因转录水平均有所增强;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比,flhD、flgC、sidA转录水平均显著降低。表明cysE基因缺失降低了APEC生物被膜形成能力及运动能力,且RyhB基因缺失对cysE基因的运动能力调控作用有代偿作用,RyhB、cysE基因均通过调节与生物被膜形成相关的基因(flhD、flgC、sidA)转录水平调控APEC生物被膜形成能力,本研究结果为研究RyhB-cysE基因对APEC的调控作用奠定了基础。

基于非标记定量蛋白质组学技术研究RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力

为从蛋白水平上探究ryhb对大肠杆菌酸性耐受力相关基因的影响,本研究采用非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株和△ryhb基因突变株进行蛋白质组学的差异性比较,并利用荧光定量PCR技术进行验证。本实验共检测到121个差异表达蛋白,其中44个蛋白的表达水平上调,19个蛋白的表达水平下调。为研究ryhb对表达蛋白的影响情况,并鉴定受其调控的相关基因,从上述差异蛋白中筛选出了hdea、hdeb、gada、gadb等与酸性耐受力相关的蛋白,并在基因水平进行验证。本研究表明,ryhb基因的缺失可能与上述4个耐酸基因转录水平上调相关,进而增强APEC耐酸性。本实验为初步探究ryhb调控通路,对APEC致病性影响提供了一定的实验依据。

不同耐药表型肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与RyhB基因的关联性

目的探讨呼吸道感染分离的不同耐药表型肺炎克雷伯菌(KP)生物膜形成能力与RyhB基因的相关性及其临床意义。方法收集2018年10月2019年10月该院呼吸道感染分离的46株KP,检测菌株的耐药性,构建KP体外感染模型并通过结晶紫染色法定量检测KP生物膜形成能力;采用PCR法扩增RyhB基因。结果46株KP根据耐药谱分为4个耐药表型,耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)6株(占13.0%),产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌(ESBLsKP)18株(占39.1%),多重耐药肺炎克雷伯菌(MDRKP)13株(占28.3%),高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)9株(占19.6%)。科室来源排名前3为重症监护室11株(占23.9%),呼吸科8株(占17.4%),神经外科7株(占15.2%)。CRKP生物膜形成能力低于产ESBLsKP、MDRKP(P<0.05);HvKP生物膜形成能力低于产ESBLsKP、MDRKP(P<0.05);CRKP与HvKP生物膜形成能力比较差异无统计学意义(P=0.802);产ESBLsKP与MDRKP生物膜形成能力比较差异无统计学意义(P=0.466)。产ESBLsKP和MDRKP存在特异性条带,CRKP和HvKP不存在特异性条带。不同耐药表型与RyhB基因表达的交互作用与生物膜形成能力有关,且RyhB基因阴性表达时,会导致生物膜形成能力下降。结论该院的产ESBLsKP和MDRKP有较强的生物膜形成能力并容易携带RyhB基因,RyhB基因正调控KP生物膜的合成。