S/D法灭活血液制剂中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸的脂包膜病毒，其中RNA病毒为水疱性口炎病毒（VSV），DNA病毒为伪狂犬病毒（PRV），将两种指示病毒分别用于验证S／D法处理对纤维蛋白原、凝血酶原复合物、凝血因子Ⅷ、静注丙种球蛋白、免疫血浆等血液制剂的病毒灭活效果。结果该法对所有被处理的血液制剂中的PRV及VSV灭活能力分别为≥3.38－5.88和≥3.50－4.75logTCID50／0．1ml，表明S／D法对两种病毒核酸类型的脂包膜病毒有良好的灭活效果。

S/D处理纤维蛋白原制品灭活病毒后去除S/D的方法研究

以低温乙醇法从人血浆中分离的组分Ｉ（Ｃｏｈｎ’ｓ组分Ｉ）为原料，采用有机溶剂／表面活性剂（Ｓ／Ｄ）法进行病毒灭活处理，并用乙醇沉淀法去除Ｓ／Ｄ。实验结果证明：用Ｓ／Ｄ处理的Ｃｏｈｎ’ｓ组分Ｉ经８％的乙醇２次沉淀后，其Ｔｗｅｅｎ８０残留量＜２０μｇ／ｍｌ，ＴＮＢＰ残留量＜１０μｇ／ｍｌ。用醋酸纤维薄膜电泳法测定，纤维蛋白原纯度为９２．７５％，可凝固蛋白含量为９５．５２％，相对回收率为８７．４６％（ｎ＝３）；Ｓ／Ｄ处理前后纤维蛋白原的凝固活力分别为８．０６±０．０８和８．９４±０．７０。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＩＥ电泳和分子筛凝胶层析（ＦＰＬＣ）显示无变性的纤维蛋白原存在，提示：乙醇低温条件下沉淀去除Ｓ／Ｄ，不仅能保持纤维蛋白原的生物活性和天然结构基本不变，且可使制品进一步纯化。

S/D法处理凝血因子浓缩物类制品的病毒灭活验证

以水泡性口炎病毒 (VSV)为指示病毒 ,验证应用有机溶剂 /去污剂 (简称S/D)法灭活血液制品中病毒的生产工艺 ,并对不同厂家不同批号的四种凝血因子浓缩物类制品 (中间品 )的病毒灭活效果进行了分析总结。结果表明当制品中TNBP和Tween80终浓度为 0 3%和 1 0 % ,在 2 5± 1℃处理 6小时后对于包膜病毒确有显著的灭活效果。

S/D法处理凝血因子浓缩物类制品的病毒灭活验证

以水泡性口炎病毒(VSV)为指示病毒,验证应用有机溶剂/去污剂(简称S/D)法灭活血液制品中病毒的生产工艺,结果表明S/D法对于包膜病毒有显著的灭活效果。

S/D处理结合低pH放孵灭活静注人免疫球蛋白

在低ｐＨ静脉注射用人免疫球蛋白（ＩＶＩＧ）的制备中，采用有机溶剂／表面活性剂处理和低ｐＨ放孵（２３°Ｃ～２５°Ｃ，２１天）进行病毒灭活，以提高ＩＶＩＧ的安全性，两法累积灭活效果为：＞８ｌｏｇＨＩＶ－Ⅰ；＞１１．３ＬｏｇＶＳＶ和＞１０．８ＬｏｇＳｉｎｄｂｉｓ。

S/D处理人纤维蛋白原的病毒灭活验证

在人纤维蛋白原制备工艺中增加Ｓ／Ｄ处理灭活病毒步骤，ＴＮＢＰ和Ｔｗｅｅｎ８０终浓度分别为０．３％和１％，在２５℃处理６小时能有效灭活指示病毒ＶＳＶ（〉３．７５Ｌｏｇ）、Ｓｉｎｄｂｉｓ（〉４．４６Ｌｏｇ）、ＨＩＶ（〉３．６７Ｌｏｇ）。

运用S/D法和膜过滤法对人凝血因子Ⅸ中辛德毕斯病毒和猪细小病毒灭活/去除效果的验证

目的验证运用有机溶剂/去污剂(S/D)处理法和膜过滤法对人凝血因子Ⅸ中辛德毕斯病毒(Sindbis virus)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活/去除效果。方法采用S/D处理法灭活人凝血因子Ⅸ中添加的Sindbis virus,噬斑滴定法检测灭活前后的病毒滴度;膜过滤法去除添加的PPV,细胞病变法检测去除前后的病毒滴度。结果经S/D处理法灭活后,3批人凝血因子Ⅸ中Sindbis virus降低量分别为>4.62 lgPFU/mL、>4.64 lgPFU/mL、>4.50 lgPFU/mL。经Planova 15N膜过滤后,3批人凝血因子Ⅸ中PPV降低量分别为≥4.50 lgTCID50/0.1 mL、≥4.56 lgTCID50/0.1 mL、≥4.38 lgTCID50/0.1 mL。结论通过对指示病毒的验证效果评估,证明运用S/D法和膜过滤法对人凝血因子Ⅸ中的Sindbis virus和PPV均有较好的灭活/去除效果。

四种病毒灭活方法用于登革病毒灭活效果的比较

目的评价常用病毒灭活方法对血液制品中登革病毒(DENV)的灭活效果。方法将单采新鲜冰冻血浆(FFP),人凝血因子Ⅷ(FⅧ)和静脉注射免疫球蛋白(IVIG)3种血浆及其制品中加入高滴度(8.00-9.25)的登革病毒液,分别采用亚甲蓝(MB)光化学法灭活FFP、有机溶剂/去污剂(S/D)法灭活FⅧ、低pH常温孵化法和巴氏消毒法灭活IVIG;以1×10~6/mL A549细胞接种于T25的培养瓶中作为病毒传代及滴度滴定指示细胞,将灭活前后的血浆及制品接种于A549细胞并检测其DENV滴度,并通过qRT-PCR对DENV RNA做定量检测;评估不同的灭活方法对DENV的灭活效果。结果 DENV滴度下降:MB光化学法灭活FFP下降滴度≥5.92 log,S/D法灭活FⅧ下降滴度≥5.17 log、巴氏法和低pH法灭活IVIG均下降滴度≥5.92 log,其中MB光化学法灭活FFP、SD灭活FⅧ及巴氏法灭活IVIG后DENV RNA(cp/mL)降低1.25 log-2.25 log,低pH法灭活IVIG后DENV RNA(cp/mL)降低0.17 log。所有血浆和血液制品样品经灭活后,在DENV宿主细胞上3代盲传后均未检测到DENV RNA。结论 4种常用病毒灭活方法均能有效灭活血浆及血液制品中的DENV。

联合应用S/D法和膜过滤法灭活/去除凝血酶病毒效果的验证

目的验证联合应用S/D法和膜过滤法灭活/去除凝血酶病毒的效果。方法采用S/D法灭活凝血酶中间体的乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),膜过滤法去除猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和呼肠孤病毒Ⅲ型(reovirus3,Reo3),细胞病变法测定病毒滴度;参照《中国药典》三部(2010版)要求,测定聚山梨酯80和磷酸三丁酯的残留量,并检测样品病毒灭活/去除前后的效价、蛋白质含量及相对分子质量。结果 S/D法可有效灭活脂包膜指示病毒,膜过滤法可在一定过滤量范围内去除PPV和Reo3指示病毒。梨酯80和磷酸三丁酯残留量符合《中国药典》三部(2010版)限度要求;样品经灭活/去除病毒后,效价提高了8.5%,蛋白质含量提高了12.7%,灭活前后相对分子质量范围无明显变化。结论联合应用S/D法和膜过滤法可用于凝血酶及其他血液制品的病毒灭活/去除工艺,以提高制品的病毒安全性。

S/D法对人凝血因子Ⅷ产品中人免疫缺陷病毒灭活效果的研究

目的研究S/D法对人凝血因子Ⅷ中污染的人免疫缺陷病毒灭活效果。方法采用细胞培养法,对S/D处理人凝血因子Ⅷ灭活HIV的效果进行了检测。结果在常温(25℃)条件下,在污染有HIV的人凝血因子Ⅷ种混入体积分数9%S/D灭活剂,作用60 min,HIV灭活对数值为6.83。重复处理3批人凝血因子Ⅷ制品,对HIV均达到完全灭活,经细胞培养盲传三代,均未出现细胞病变。结论 S/D法能够完全灭活人凝血因子Ⅷ产品中污染的人免疫缺陷病毒,灭活效果可靠。

静脉注射免疫球蛋白制备中的病毒灭活

在静脉注射免疫球蛋白（ＩＶＩＧ）的制备中，采用有机溶剂结合表面活性剂（Ｓ／Ｄ）处理或６０℃１０小时液态加热（巴氏灭活法）的方法对组分Ⅱ（ＩｇＧ）进行病毒灭活处理，灭活效果用指示病毒进行了评价，结果表明：Ｓ／Ｄ法可有效灭活脂包膜病毒ＶＳＶ和Ｓｉｎｄｂｉｓ，巴氏灭活法则对上述病毒以及Ｖａｃｃｉｎｉａ和Ｅｃｈｏ病毒均有较好的灭活作用。经病毒灭活处理的免疫球蛋白，在理化及生物学特性上基本未受到不利影响，用两种方法分别处理组分Ⅱ后制备的ＩＶＩＧ，其主要特性指标均符合该制品的有关质量规定。

凝血酶原复合物病毒灭活的研究

从Cohn’s组分Ⅲ制备凝血酶原复合物（简称PCC），并经S／D处理灭活病毒。通过加入标志病毒（VSV、Sindbis、仙台及EMC）考察病毒灭活效果。结果显示，因子Ⅱ、Ⅸ活性总回收率分别为52．2％和22．3％，纯化倍数分别为3．5和1．5，均比原制备工艺提高约2倍。对标志病毒的灭活效果分别达107．55TCID50／ml（VSV）、107．27TCID50／ml（Sindbis）、108．25TCID50／ml（仙台），而对非脂膜病毒EMC的灭活小于100．2TCID50／ml，表明S／D对灭活脂膜病毒有效，而对非脂膜病毒无效。TNBP残留量小于10ppm，Tween80残留量小于100ppm。所得制剂的溶解性及外观均比原制备工艺所得制剂有明显改善。

纤维蛋白原制剂灭活病毒工艺的初步研究

在纤维蛋白原(简称纤原)常规生产工艺中增加“有机溶剂/表面活性剂(S/D)”灭活病毒步骤·TNBP及Tween-80浓度分别为0.3％及1％,在24℃处理6小时,能有效灭活标志病毒VSV(7.31g_(10))及Sindbis V(6.831g_(10))。残余的TNBP及Tween-80可通过两次8％乙醇沉淀去除。病毒灭活后纤原的可凝固蛋白纯度由原来的70.9±8.5％提高至85.5±6.0％,回收率可保持在64.7±3.8％。PAGE电泳显示来出现新的蛋白区带。

有机溶剂/去污剂病毒灭活处理对破伤风抗毒素质量的影响

目的 探索用有机溶剂/去污剂(solvent/detergent, S/D)病毒灭活处理对破伤风抗毒素质量的影响。方法 3批破伤风抗毒素样品,每批样品取3等份,向其中2份中分别加入磷酸三丁酯(tri- n -butylphosphate, TNBP)和吐温-80(Tween 80)至终质量分数为0.3%和1%;一份放置在(25±1)℃水浴中振摇6 h后取样,另一份放置在(30±1)℃水浴中振摇4 h后取样;向第3份破伤风抗毒素原液中加入等量的生理盐水混匀后室温放置作为对照。各样品经超滤后检测其效价和蛋白质含量,同时用SDS-PAGE电泳和凝胶过滤色谱柱测定。结果 破伤风抗毒素原液样品经过S/D病毒灭活处理后,其动物效价与对照相比差异无统计学意义( P >0.05),蛋白质含量、分子大小分布无明显变化,多聚体、二聚体及F(ab′) 2含量也无明显变化。结论 S/D病毒灭活处理对破伤风抗毒素的效价,蛋白质含量,分子大小分布,多聚体、二聚体及F(ab′) 2含量均无明显影响,可以作为破伤风抗毒素病毒灭活的候选方法。

长链核酸扩增技术评价病毒灭活效果的研究

目的:探讨用长链核酸扩增技术评价病毒灭活效果的可行性。方法:针对伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)糖蛋白gD基因前后的保守区设计预计产物长短不一的5对引物,用半巢式PCR技术扩增经低pH法(4.0±0.1)、巴氏消毒法(60±1.0)℃和S/D法(有机溶剂/洗涤剂)处理后的PRV核酸,同时以细胞感染法做平行对照。结果:低pH对PRV核酸有破坏作用,处理时间越长,核酸损伤程度越明显,处理60min时,6.62lgTCID50的PRV完全被灭活。5条不同长度PCR扩增产物中,只有3.9kb的长片段检出与细胞培养结果一致。7.25lgTCID50的PRV经(60±1.0)℃处理20min后即被完全灭活,7.13lgTCID50的PRV经S/D法处理1h后被完全灭活,但各长度核酸片段扩增均为阳性,与细胞感染试验结果不符。结论:低pH对PRV核酸的损伤程度随处理时间的延长而增加;用长链PCR(3.9kb)技术来评价经低pH法灭活病毒的效果是可行的,而该法不适合评价巴氏消毒法和S/D法灭活病毒的效果。