大连地区无偿献血者隐匿性乙型肝炎病毒感染pre-S/S区基因分析

目的了解大连地区无偿献血者隐匿性肝炎乙型病毒感染(OBI)的情况和pre-S/S区基因的变异情况。方法对大连市血液中心2010年12月2日-2013年5月31日的无偿献血者血液标本进行常规ELISA(HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP)和HIV/HBV/HCV联合NAT筛查,对于单独核酸检测反应性的献血者加以跟踪或回溯,结合乙型肝炎血清学标志物的试验、鉴别试验、病毒定量试验和半巢式PCR来确定OBI,同时对OBI的pre-S/S区基因序列与对照组(HBs Ag+序列,Genbank)做比对分析。结果共筛查158 232份血液标本,确定了其中的69份OBI,流行率为1∶2 293(69/158 232)。41例OBI获得pre-S/S区基因序列:B型6例、C型34例、D型1例;与对照组相比,OBI在S区的氨基酸序列的变异明显(PB=0.013;PC=0.003),主要变异位点为B型的V14G/A、Y161F/S、V168A、P217L和C型的E2G/A/V、T118R/K/A/M、P127T/L/H/S、E164D/G、L175S、S174N。结论大连地区献血者OBI在HBV基因组S区的氨基酸序列存在多个位点的变异,这些变异与OBI的产生存在某种关系,且这种关系受基因型的影响。

乙型肝炎病毒S区基因变异研究进展

乙型肝炎病毒（HBV）为一嗜肝细胞DNA病毒,不仅可以引起隐匿性、急性和慢性病毒性肝炎,还与肝硬化和肝细胞癌的发生发展密切相关。虽然通过对HBV和宿主及其相互作用的研究,已经发展了有效的预防疫苗和多种抗病毒药物,但HBV感染仍是世界范围内的公共健康问题[1-2]。本文针对HBV S基因的结构和功能上,以及目前关注较多的免疫逃逸、隐匿性肝炎和耐药突变引起方面S基因变异的研究进展作一综述。

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据。方法采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100~200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20~99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认。结果设计3对巢式PCR引物(P1~P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因。经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功。自建两轮PCR法设计了P4~P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因。经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18%)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL。结论基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析。

HBV-DNA高水平孕妇的HBV前S和S区基因突变及基因分型

【目的】研究HBV-DNA高水平孕妇的HBV前S(前S1和前S2)及S区的基因突变模式和基因分型,为从病毒因素探讨HBV母婴传播免疫阻断失败提供实验基础。【方法】选取血清HBsAg阳性且HBV-DNA≥105 IU/mL的孕妇41例,提取血清HBV DNA,靶向设计HBV各基因型的前S及S区通用引物,经PCR扩增测序进行序列分析,检测和分析前S及S区基因的突变情况,并进行基因分型。【结果】①在41例样本中,共有29例(70.73%)样本存在前S1、前S2及S区基因突变,突变方式以碱基置换为主;前S1、前S2及S区基因的突变频率分别为8.96%、9.88%和3.24%,前S1和前S2区的突变频率显著高于S区(P<0.05)。②对41例样本根据S区点突变的特点进行基因分型及同源树簇集分析,结果B基因型22例,C基因型19例,两基因型在全S区的基因突变频率相比,差异无统计学意义(P>0.05);B、C两基因型分别形成独立的簇集,簇集间同源性<90%,但簇集内B、C两个基因型的同源性分别达96%和95%。【结论】①HBV-DNA高水平孕妇的HBV前S及S区的基因突变普遍存在,突变形式以碱基置换为主,突变频率以前S1和前S2区常见,S区则相对稳定;②不同HBV基因型间同源性差异较大,按HBV不同基因型分别进行前S和S区基因突变模式的分析将更有意义。

昆明地区HBsAg与抗-HBs双阳性慢性HBV感染患者流行病学调查及PreS/S基因突变特征

目的探讨昆明地区HBsAg与抗-HBs(Anti-HBs)双阳性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者流行病学及PreS/S基因突变特征。方法选择2018年5月—2022年4月于云南大学附属医院住院及门诊定量检测乙肝两对半的438例慢性HBV感染患者为观察对象,将202例HBsAg(+)/抗-HBs(+)患者作为观察组,将236例HBsAg(+)/抗-HBs(-)患者作为对照组,对比两组患者临床特征。使用巢式聚合酶链反应扩增出PreS/S基因全长序列,确定基因型并分析PreS/S基因突变特征。结果观察组患者在<10岁及高于80岁人群中的流行率较高,而对照组在20~49岁人群中的流行率较高。与对照组比较,观察组患者年龄、HBsAg<250 IU/mL比例、C型HBV感染及乙肝携带者比例均显著增加(P<0.05)。成功扩增PreS/S并测序成功的观察组样本共132例,其中B型基因81例,C型基因51例;对照组样本中B型基因110例,C型基因65例。B型基因患者中,与对照组比较,观察组N末端区域突变率明显增加(P<0.05)。C型基因患者中,与对照组比较,观察组MHR、a决定簇及N末端区域突变率明显增加(P<0.05)。在观察组中,81例B型基因患者中PreS基因缺失突变14例(17.28%),51例C型基因患者中PreS基因缺失突变19例(37.25%),而在对照组中未发现PreS基因缺失突变。结论HBsAg/抗-HBs双阳性HBV感染者在<10岁及高于80岁HBsAg阳性人群多见,HBsAg/抗-HBs双阳性可能与HBsAg突变及PreS基因突变有关。

HBV S区基因变异与HBsAg检测

乙型病毒性肝炎是世界范围内最常见的病毒感染性疾病,全球约3亿～4亿人存在活动性HBV感染,有约1/3的人口存在HBV暴露史.HBV是人类第一个从基因组水平及蛋白水平被认识的肝炎病毒.临床实验室对HBV感染或献血员进行血液检查在预防HBV的垂直及水平传播上具有非常重要的意义.自20世纪60年代末首次引入HBV感染的血清标志物（即HBsAg）以来,HBV感染后血清标志物的检测方法不断进步,新的乙型肝炎分期及随访标志物也不断被发现.

HBV前S区的基因克隆及序列测定

目的：获取 Ｈ Ｂ Ｖ 前 Ｓ区基因（ Ｈ Ｂ Ｖ Ｐｒｅ Ｓ），并进行序列测定，为今后研究其机理及应用创造条件． 方法：用 Ｐ Ｃ Ｒ方法从含 Ｈ Ｂ Ｖ 基因组的模板中扩增 Ｐｒｅ Ｓ基因，重组入 Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 载体，用自动测序仪，采用荧光素标记的引物，测定目的基因的序列． 结果：成功地扩增到 Ｐｒｅ Ｓ区全长基因，测出的序列与已知的 Ｈ Ｂ Ｖ 病毒的ａｄｒ 亚型的前 Ｓ区基因序列一致． 结论：构建了含 Ｐｒｅ Ｓ区基因的重组克隆，为以后的深入研究奠定了基础．

乙型肝炎病毒前S基因区缺失突变发生机制的探讨

检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者和患者外周血内HBV前S区基因缺失突变的分子结构特点,探讨其发生机理。用聚合酶链反应方法从慢性乙肝患者和携带者血清中扩增出前S区基因片段,克隆、测序,分析缺失发生的结构特点,从而推测这些前S区基因缺失突变的产生机制。从262例慢性乙肝患者和103例无症状HBV携带者体内扩增出前S区片段,共在30例患者和携带者中检测出多种前S区基因缺失突变,主要集中于前S1区的3′端和前S2区的5′端。其中有9例患者和携带者体内存在完全一样的nt3019～nt3201183bp的缺失突变,该缺失突变符合真核细胞mRNA剪接机制,在此位置上各基因型的序列高度保守。同时有另外两种缺失突变,即nt3019～nt3147129bp缺失、nt3019～nt310991bp缺失也符合该剪接机制。有23种缺失突变部分于重复序列之间,符合逆转录过程中的模板转换机制所导致的缺失。根据前基因组RNA预测出二级结构,仅部分缺失突变在RNA二级结构中对应于局部的结构。此结果表明:HBV在外界因素mRNA的剪接机制和内在因素聚合酶蛋白的功能特点的共同作用下,产生各种突变,不同的机制将导致不同类型的缺失突变。除真核细胞mRNA剪接机制外,逆转录过程中的模板转换是主要机制之一。

广西不同时期IBV分离株S1基因高变区Ⅰ的遗传变异分析

对广西1985-2007年间分离到的22株传染性支气管炎病毒（IBV）的S1基因高变区I（HVRI）进行序列测定，并与发表的其他IBV参考株及鸽子分离的冠状病毒株的基因序列进行比较和分析。系统进化关系显示毒株可分为5个基因群，其中有16个广西分离株属第1群，它们与鸽子冠状病毒分离株的氨基酸序列同源性较高，与Massachusetts（Mass）型疫苗株的同源性较低。有15个分离株在33-34位和34～35之间分别有4个和3个氨基酸残基的插入，GX-NN6在33～34位和34～35位之间则均有4个氨基酸残基的插入；GX-YL1、GX-NN2与常用的Mass型疫苗株的亲缘关系最近，同属于第Ⅱ群；GX-G、GX-XD与日本同一时期分离的毒株JP Miyazaki 89亲缘关系最近，属于第Ⅲ群；GX-YL6、GX-NN7与欧洲毒株4／91亲缘关系较近，属于第V群。结果表明广西存在着多种类型IBV毒株的流行，毒株S1基因HVRI碱基的突变或插入比较普遍，可导致其氨基酸序列的变化，绝大部分毒株与目前常用的Mass型疫苗株的亲缘关系较低。同一时期的分离株同源性较高，但无明显的地域性差异。

广西1985年～2008年IBV分离株S1基因高变区Ⅰ和N基因的序列和系统进化分析

为了解广西传染性支气管炎病毒(IBV)的纤突蛋白S1基因高变区Ⅰ(HVRⅠ)和核(N)蛋白基因变异情况及S1和N基因变异的相关性,本研究应用RT-PCR方法扩增了广西1985年～2008年的21株IBV的S1基因HVRⅠ和N基因,并进行了克隆、序列测定及分析。结果发现:广西存在着多种基因型IBV流行;广西IBV分离株S1基因存在广泛的点突变和插入现象;N基因序列存在氨基酸替代现象。21株IBV中12株在S1基因HVRⅠ和N基因遗传进化树中均归属相同群,其余毒株却归属不同的群。2005年分离的GX-NN5存在基因重组现象。以上结果表明了广西IBV毒株存在基因突变和基因重组现象,S1和N基因的变异不完全平行,有些毒株间的S1和N基因差异很大。

汉滩病毒S基因免疫小鼠的细胞免疫应答的初步观察

将汉滩病毒S片段编码区基因插入到含CMV启动子 /增强子 (promoter/enhancer)的真核表达载体pVR10 12中 ,构建成真核表达质粒 pVRS2 2。质粒DNA经纯化后 ,注射经布比卡因预处理的Balb/c小鼠的股四头肌 ,多次免疫后 ,免疫小鼠淋巴细胞增殖功能的检测结果显示 :免疫鼠的脾细胞能够对体外抗原刺激产生增殖反应 ;CTL活性检测结果表明 :靶细胞51Cr的释放是效应细胞依赖性的 ,并且与病毒感染组的淋巴细胞的细胞毒活性相似。结果显示 ,用重组质粒pVRS2 2免疫小鼠 ,能够诱导小鼠产生特异性淋巴细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞活性(CTL)。

隐匿性乙型肝炎病毒感染者病毒基因跨膜结构变异性分析

目的分析隐匿性乙型肝炎病毒(HBV)感染(OBI)者血清样本中HBV S区基因跨膜结构(TM)突变导致的氨基酸替换现象,探讨造成HBV表面抗原(HBsAg)漏检的原因和临床意义。方法选取上海中医药大学附属第七人民医院检验科采集的28例OBI患者血清样本(OBI组)和10例慢性HBV感染(CHB)患者血清样本(CHB组)。采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增OBI组和CHB组HBV S区基因,扩增产物分别进行克隆测序和直接测序,进而进行核苷酸序列比对分析。结果OBI组TM1~TM4共26个位点发生185次突变,突变率为3.1%(185/6052),TM1、TM2、TM3、TM4突变率分别为1.6%(16/1020)、2.2%(28/1292)、4.2%(97/2312)、3.1%(44/1428)。CHB组TM发生4次突变,突变率为0.4%(4/890),TM1、TM2、TM3均未发生突变,TM4突变率为1.9%(4/210)。OBI组TM突变率、TM4突变率均高于CHB组,差异均有统计学意义(χ^(2)=19.92,P<0.01;χ^(2)=0.89,P=0.03)。OBI组TM1、TM2、TM3、TM4亲水性突变率分别为62.5%(10/16)、71.4%(20/28)、38.1%(37/97)、20.5%(9/44),4者比较差异有统计学意义(P<0.01)。OBI组共发现7种精氨酸替换突变,分别为C85R、L162R、W163R、W172R、L186R、W191R、C211R。结论HBV S区基因TM突变导致疏水性氨基酸替换为亲水性氨基酸,会导致临床上HBsAg的漏检,产生OBI现象。

活化富集对土壤样品微生物菌群组成的影响

地球上的微生物绝大多数仍处于未培养状态。微生物的分离培养有助于新物种资源、新天然产物的发现和应用,也有助于对微生物开展生理生化、代谢潜能、演化和生态功能等方面的基础研究。活化富集对于自然生境中微生物的分离培养至关重要。本研究通过16S rRNA基因V3~V4区扩增子测序和宏基因组测序分析了土壤样品不同培养基(WB、PJ、WB/10和PJ-M)、不同活化时长(1~29 d)和不同活化条件(有氧和厌氧)对微生物活化富集的影响。发现活化培养基、培养条件和活化时间的不同会显著影响活化富集后样品的菌群组成。其中,采用营养成分浓度相对较低的培养基(WB/10)、延长活化时长(活化5~29 d)有利于提高活化富集后样品微生物群落的多样性,以及CPR等微生物暗物质的活化及检出。对后续微生物,特别是微生物暗物质的分离培养具有一定的指导作用。

接种乙型肝炎疫苗后HBsAg携带者病毒基因S区“a”决定簇变异

目的 探讨乙型肝炎疫苗普种后人群HBVDNA基因组S区“a”决定簇的变异率。方法 对 72例疫苗接种后HBsAg携带者HBVDNA基因组S区“a”决定簇进行了序列分析。结果 在4例小儿血清中发现有 145Arg、140Ile和 12 6Ser变异株各 1例 ,12 6Ser变异株与野毒株混合感染 1例 ,变异率为 5 .5 6 %。同时发现近 30年来我国乙型肝炎病毒亚型发生了明显的变迁。结论 疫苗接种可能会引起病毒变异 ,且现有疫苗不能预防变异株感染及变异株可能发生传播。

传染性支气管炎病毒的分离及其S1基因高变区Ⅰ的遗传变异性分析

应用鸡胚尿囊腔接种的方法,从广西某一鸡场两群分别为48日龄和7日龄疑患传染性支气管炎的鸡中分离到两株传染性支气管炎病毒(IBV)(分别命名为GX-NN1和GX-NN2);利用反转录-聚合酶链式反应技术对分离株S1基因高变区Ⅰ(HVRⅠ)进行扩增并测定其核苷酸序列,以分析分离株遗传变异的情况。结果表明,两个分离毒株HVRⅠ核苷酸之间的同源性仅为76.3%,分离毒株与参考毒株的同源性在69.3%～99.1%之间;其中分离株GX-NN2与疫苗株H120、H52、Ma5、D41和标准株M41、Beaudette的同源性比较高(95.6%～99.1%),同属一个分支;而分离株GX-NN1则与这些参考毒株的同源性比较低(74.6%～75.4%),独自成为另一个分支。本研究的结果提示,广西养鸡业现场流行的IBV毒株已经发生了变异。

贵州传统小曲酵母菌分子指纹图谱分析

采用26S rRNA基因D1/D2区域序列分析方法将59株分离自贵州5个不同地区传统小曲的酵母菌鉴定为6个酵母菌种:1株阿萨丝孢酵母(Trichosporon asahii)、32株扣囊覆膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、8株Saccharomycopsis malanga、4株伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)、6株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)和8株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本研究展示了6个酵母菌种的WL培养基菌落特征和5.8S rRNA基因ITS区限制性片段长度多态性酶切图谱特征,为这6个菌种的快速鉴定提供依据。在菌种鉴定的基础上,本研究进一步采用串联重复-tRNA指纹图谱法分析酵母菌的种内差异,共展示了17个基因型,H.burtonii、W.anomalus与S.fibuligera分别鉴定出4、3种和8种基因型,其中S.fibuligera基因型10、11、12、15、16与17之间的遗传关系较近,而其余菌种内部基因型之间的遗传关系相对较远。

HBsAg ELISA阴性血液中HBV DNA、HBVNRAg检测情况及HBV基因变异分析

目的研究献血者HBsAg ELISA筛查阴性血液中HBV漏检情况,分析漏检血液中HBV基因型、血清型及S区基因变异与漏检的关系。方法收集从2013年11月-2015年10月HBsAg ELISA筛查阴性血液31 184份,以高敏HBV DNA及HBV核酸相关抗原(HBVNRAg)方法检测;测定分析HBV DNA阳性者HBV基因序列。结果 31 184份标本中,HBVNRAg全部阴性,HBV DNA阳性82例,检出率0.26%(82/31 184),其中,HBV B型79例(79/82,96.3%),C型3例(3/82,3.7%)。血清型全部为adw(82/82,100%);检测到27个样本分别存在S区突变(27/82,32.9%),其中的21个氨基酸位点突变都集中在主要亲水区(major hydrophilic region,MHR)HBsAg第99~169位氨基酸之间。主要突变位点有S区133号氨基酸位点(7/82,8.5%);126号位(6/82,7.3%);161号位(5/82,6.1%);134号位(4/82,4.8%);145号位(2/82,2.4%),其他还检测到121、122、125、128、129、131、132、140、143、150、156、157、158、159、164、166共计21个氨基酸位点47种突变。结论 HBVNRAg对血筛意义不大,HBsAg第99~169位氨基酸之间MHR免疫逃逸变异是导致酶免法筛查漏检的主要原因之一,其它漏检可由血液中HBsAg浓度较低而检测试剂灵敏度不够等原因引起。血液筛查加入核酸检测方法,能够有效减少单独酶免法检测漏检现象,显著提高血液安全性。

乙型肝炎病毒前 S／S 基因变异的研究进展

HBV 基因组由4个重叠开放读码框架 X 、P 、C 和 S 组成，分别编码 X 蛋白、聚合酶、核心蛋白和表面蛋白，其中前 S／S区基因变异与肝细胞癌、HBV 再活化、乙型肝炎疫苗接种失败、暴发性肝炎的发生、发展有关。现针对 HBV 前 S／S 基因变异以及与乙型肝炎相关性肝病之间的关系概述如下。