山羊草属S基因组与小麦属B／G基因组RAPD标记和特异DNA片段克隆及研究

本研究利用132个随机引物，对山羊草属和小麦属11个种的DNA进行扩增。对其中特异RAPD扩增产物进行克隆，然后用其做探针与小麦族23个种属DNA的RAPD扩增产物进行Southern杂交。共得到24个特异克隆：其中小麦族共有特异克隆1个，山羊草属和小麦属共有特异克隆2个，S基因组特异克隆2类7个，B／G基因组特异克隆2类6个，S基因组与B／G基因组共有的特异克隆8个。24个特异克隆中有22个测定了序列，其中15个为Fasta数据库里显示未见报导的序列。用这24个特异DNA克隆制成的探针与相应的23个材料经HindⅢ酶切消化的总DNA进行Southern杂交，发现其中7个可做为基因组特异探针。通过对24个特异DNA克隆分析研究表明：①S基因组是由两个基本不同的类型构成的，即拟斯卑尔脱山羊草为一个类型，其余4个S组山羊草为另一类型；因此建议前者基因型符号仍保留为“S”，而其余4个种之间无明显不同，故应把基因组符号统一为“S^1”②S基因组是小麦B／G基因组的供体，而拟斯卑尔脱山羊草可能是最主要的供体，但并不排除其余S基因组的种参与了B／G基因组形成的可能；研究还表明B基因组与S基因组还是有很大区别的，并已找到了B基因组的特异标记。

水稻瘤矮病毒基因组S9片段的基因结构特征

应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒(RGDV)中国广东信宜分离物(RGDV-C)的基因组S9片段,测定了全序列并进行了生物信息学分析。结果表明,RGDV-C S9片段全长共有1202bp(登录号AY556483),含有一个长的开放阅读框,这一开放阅读框编码一个由323个氨基酸残基组成的多肽,推测分子量约35.6kDa,与泰国分离物(RGDV-T)的全序列相比,它们的核苷酸长度相等,核苷酸同源性为98.1%,氨基酸同源性为98.5%。RGDV S9片段编码的Pns9蛋白在植物呼肠孤病毒属内未发现同源蛋白,其功能尚待确定。利用NCBI的BLAST查找与比较,发现Pns9与伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)ATP依赖的Clp蛋白水解酶组分[ATP-dependent Clp prote-ase proteolytic component(clpP-1)]有21.8%的氨基酸序列同源性。

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S7的cDNA克隆及全序列分析

应用RT PCR技术克隆了 2个水稻黑条矮缩病毒 (riceblack streakeddwarfvirus,RBS DV)中国分离物 ,即浙江分离物和河北分离物的基因组片段S7,并测定了他们的全序列。结果表明 :RBSDV浙江分离物 (RBSDV Zj)基因组片段S7全长 2 1 93nts(EMBL登录号为AJ2 9742 7) ,RBSDV河北分离物基因组片段S7全长 2 1 90nts(EMBL登录号为AJ2 9742 8) ,二者均含有两个开放阅读框 (openreadingframe,ORF) ,分别编码约 41kD和 3 6kD多肽 ,2个中国分离物核苷酸同源性高达 99% ,相应的ORF编码的多肽同源性分别为 1 0 0 %和 94 4% ,与日本RBSDV基因组片段S7核苷酸同源性为 93 4%和 93 8% ,相应ORF编码的多肽同源性分别为98 1 % (ORF1 )、96 5 %和 97 8% (ORF2 ) ,与意大利MRDVS6核苷酸同源性为 85 1 %和85 3 % ,相应多肽同源性分别为 92 3 % (ORF1 )、85 5 %和 86 8% (ORF2 )。

水稻瘤矮病毒基因组第6片段(S6)序列测定与分析

【目的】了解水稻瘤矮病毒(RGDV)基因组结构与功能。【方法】根据已报道的RGDV基因组各片段末端序列及其反向重复特性,采用4轮RT-PCR的方法扩增RGDV基因组第6片段(S6),用生物学软件进行序列分析。【结果】得到了该病毒S6的全序列。S6全长1651bp,G+C含量39.13%,包含一个长的ORF,起始于第25位,终止于第1497位,编码490个氨基酸,分子量为53.3kD。【结论】该蛋白与伤瘤病毒(WTV)的P7的相似性为30.0%,与水稻矮缩病毒(RDV)的P7的相似性为31.7%。这是RGDVS6全序列的首次报道。

家蚕质型多角体病毒基因组片段1中的假定重叠基因检测

生物信息学分析结果显示家蚕质型多角体病毒（BmCPV）基因组s1片段中含有-个假定的重叠基因ORFX。为了检测该重叠基因ORFX是否在RNA和蛋白质水平有相应的表达产物，用大肠杆菌表达的重组ORFX蛋白制备多克隆抗体，对感染BmCPV的家蚕中肠后部组织进行Westernblotting和免疫组化检测，结果在感染BmCPV第1～7天的家蚕中肠组织中没有检测到假定的ORFX蛋白。进一步基于假定重叠基因ORFX区域及其下游序列设计定量检测ORFX基因和s1片段转录本RNA总水平的引物RECPV-1／RECPV-2，以及定量检测S1片段转录本RNA水平的引物RECPV．3／RECPV-4，用引物Oligo（dT）／RECPV-2和Oligo（dT）／RECPV-4的反转录产物作为模板，对感染BmCPV的家蚕中肠组织中的S1片段转录本和假定的ORFX转录本进行定量PCR检测，结果在感染BmCPV第5～7天的中肠组织中均没有检测到假定的ORFX转录本。由此表明，BmCPV基因组S1片段中可能不存在假定的ORFX重叠基因。

化脓性中耳炎病原谱分析及耐药性检测

目的探讨化脓性中耳炎(SOM)患者病原菌分布及其耐药性,为SOM的临床诊断及合理用药提供依据。方法收集21例SOM患者耳道分泌物,同时收集40例健康大学生耳道分泌物作为对照。采用分离培养和16S rDNA宏基因组测序比较两组耳道微生物差异,并对分离得到的病原菌进行药敏试验。结果符合16S rDNA宏基因组检测要求的17例SOM耳道分泌物中,13例检出葡萄球菌(76.47%),还检出厌氧菌普雷沃菌、韦荣球菌等。21例SOM耳道分泌物中,10例分离培养出葡萄球菌(47.6%),主要为金黄色葡萄球菌,其次是耳葡萄球菌和表皮葡萄球菌等;共分离到病原菌16株,其中革兰阳性菌14株(87.5%),革兰阴性菌1株(6.25%),真菌1株(6.25%)。健康人耳道分泌物分离的前三位细菌为头葡萄球菌、耳葡萄球菌及表皮葡萄球菌。SOM患者分离的金黄色葡萄球菌对头孢呋辛、头孢吡肟、妥布霉素等的敏感率>75.0%,对青霉素的耐药率为100%,其中1株金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药;健康人耳道分泌物中的分离菌对大多数抗菌药物的敏感性较高。结论临床应积极开展SOM的病原菌检测及药敏分析,指导临床用药,提高治疗效率。

梭状芽孢杆菌属致新生儿坏死性小肠结肠炎关联性分析

目的通过16S rRNA宏基因组测序技术和细菌培养法对肠道菌群变化与新生儿坏死性小肠结肠炎开展关联性分析。方法2018年9月至2019年3月在南京市妇幼保健院新生儿ICU病房内随机选取10例NEC病例及6例对照进行肠道菌群的16S rRNA宏基因组物种多样性分析,并对51例NEC患儿及其对照粪便样本和相应的环境样本开展梭菌属的分离与培养。结果病例组的组内样本离散程度小于对照组,样本物种多样性高于对照组;在梭菌属的分离培养中,病例组梭菌属总体检出率为43.14%(22/51),丁酸梭菌检出率最高(19.61%,10/51),且在两组间差异有统计学意义(χ^(2)=5.85,P=0.01558);全部的梭菌属菌株均未携带A,B和E型神经毒素基因。结论肠道菌群多样性升高、肠道菌群丰度与梭菌属的丰度变化可能与NEC患儿的肠道内环境状态密切相关;梭菌属特别是丁酸梭菌可能与NEC发生有关。