黄瓜S期激酶相关蛋白Skp1的原核表达及其多克隆抗体的制备

S期激酶相关蛋白1(Skp1)是SCF型E3泛素连接酶途径的核心蛋白,在真核生物的细胞周期、转录调控、信号传导等细胞进程中发挥关键作用。为了深入研究Skp1的基因功能,通过反转录PCR扩增黄瓜Skp1基因的全长阅读框,Skp1基因全长阅读框由468个核苷酸组成,共编码155个氨基酸,将其通过酶切连接的方式克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,获得重组载体pETSkp1,PCR验证及克隆测序确定开放阅读框的正确性。将重组质粒pETSkp1转化大肠杆菌BL21菌株,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,经IPTG(1 mmol/L)分别诱导3,6,9 h,Skp1基因在大肠杆菌BL21中均得到高效表达,6,9 h对表达量的影响不明显,因此,可用3 h作为后期诱导表达蛋白的时间。将纯化的蛋白作为抗原,免疫新西兰大耳白兔,采集第5次后血清用ELISA测定效价范围为1∶128000~512 000。提取黄瓜叶片的总蛋白,利用获得的抗血清进一步通过Western Blot检测特异性,结果表明,抗血清在500倍和1 000倍稀释时均能特异性地检测到黄瓜叶片中的Skp1蛋白,条带大小在20 k Da左右,与预期的Skp1蛋白大小一致。

S期激酶相关蛋白1与肝内胆管细胞癌细胞增殖、侵袭能力相关

目的观察人S期激酶相关蛋白1(SKP1)在肝内胆管细胞癌组织中表达差异并探讨其对肝内胆管细胞癌增殖、迁移及侵袭的影响.方法蛋白质印迹法(Western blot)实验测定SKP1在肝内胆管细胞癌癌组织与正常组织中表达差异;构建SKP1干扰载体及空载体,经慢病毒包装后稳定转染至肝内胆管癌细胞中,构成实验组与对照组,免疫印迹实验检测其SKP1表达变化;细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测转染后实验组与对照组增殖能力;划痕实验检测其迁移能力;Transwell实验检测其侵袭能力.结果肝内胆管细胞癌组织中SKP1表达为正常组织(1.701±0.215)倍,差异有统计学意义(t=8.512,P<0.05).慢病毒转染RBE细胞使其SKP1表达降低,蛋白质印迹法(Western blot)实验测定实验组较空白组降低(3.632±0.335)倍,差异有统计学意义(t=11.376,P<0.01).CCK-8实验显示24、48、72 h实验组较对照组相对生存率分别为(53.136±0.314)%、(42.661±0.248)%、(35.037±0.203)%,差异均有统计学意义(t=8.594、8.899、9.210,P<0.05).划痕实验显示24、48 h实验组迁移细胞数目[(41.198±3.092)、(64.773±6.437)个]较对照组[(113.487±3.514)、(168.767±8.151)个]明显降低,差异均有统计学意义(t=5.430、6.224,P<0.05).Transwell实验显示实验组穿孔细胞数目为(34.185±3.124)个较对照组[(121.234±6.814)个]明显降低,差异有统计学意义(t=9.918,P<0.05).结论肝内服管细胞癌组织中SKP1表达高于正常组织,降低SKP1表达能够抑制肝内胆管细胞癌的增殖、迁移及侵袭能力.

SKP1、SKP2对肾癌预后的预测作用分析

目的分析S期激酶相关蛋白1(SKP1)和S期激酶相关蛋白2(SKP2)表达水平对肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌这3种肾癌患者预后的预测作用。方法使用TCGA数据库中肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌样本进行SKP1和SKP2表达水平及其甲基化与预后相关性分析、不同表达水平间基因突变情况分析。采用Metascape数据库分析SKP2在这3种肾癌中共表达基因功能富集情况及蛋白质相互作用情况。结果与正常组织比较,SKP1表达水平在这3种肾癌中均显著降低,SKP2在肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌中显著升高。在这3种肾癌中SKP2高表达者预后均较差,AUC值和一致性指数提示预测准确性稳定。肾癌中多个甲基化位点与SKP1或SKP2表达水平及预后显著相关。肾透明细胞癌中SKP1和SKP2突变占14%。KMT2C、HERC2、PRKDC、SETD2和HMCN1基因突变与SKP1或SKP2表达水平高低相关。肾癌中SKP2共表达基因富集部分与免疫应答调节相关。结论SKP2及其甲基化可以预测肾癌预后。肾癌中SKP1、SKP2表达高低与KMT2C、HERC2、PRKDC、SETD2和HMCN1等基因突变相关,并受多种甲基化位点影响。

干扰SKP1基因对帕金森病细胞模型凋亡及泛素蛋白酶体系统的调控机制

目的探讨干扰S期激酶相关蛋白1(S-phase kinase associated protein 1,SKP1)基因对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导致帕金森病(Parkinson's disease,PD)细胞模型凋亡及泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)降解α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)机制的影响。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、MPP+组、SKP1干扰组、SKP1干扰+MG132(UPS抑制剂)组,对照组细胞正常培养,后三组细胞先用MPP+(0.5 mmol/L)孵育24 h作为PD模型细胞,SKP1干扰组转染慢病毒SKP1-siRNA,SKP1干扰+MG132组转染慢病毒SKP1-siRNA后加入MG132(0.5μmol/L)干预24 h。采用RT-PCR和Western blot检测细胞中SKP1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein l light chain 3,LC3)、溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein,LAMP2)、α-syn、泛素激活酶E1(ubiquitin activating enzyme E1,UBE1)、parkin、p27的基因和蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期水平,CCK-8法检测细胞增殖水平;采用免疫共沉淀法探究SKP1与p27的相互作用。使用SPSS 23.0软件进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验。结果RT-PCR和Western blot结果显示,四组细胞的自噬相关蛋白及泛素相关蛋白LC3、LAMP2、α-syn、UBE1、parkin、p27的mRNA(F=99.155,43.028,138.464,28.200,22.009,28.147,均P<0.05)和蛋白(F=245.517,157.634,315.920,2336.472,477.429,2350.201,均P<0.05)表达水平均差异有统计学意义。SKP1干扰组LC3、LAMP2、α-syn、p27的mRNA和蛋白表达水平均低于MPP+组(均P<0.05),UBE1、parkin的mRNA和蛋白表达水平均高于MPP+组(均P<0.05);SKP1干扰+MG132组LC3、α-syn、p27的mRNA和蛋白表达水平均高于SKP1干扰组(均P<0.05),UBE1、parkin的mRNA和蛋白表达水平均低于SKP1干扰组(均P<0.05)。流式细胞术和CCK-8法检测结果显示,四组间细胞凋亡率和细胞抑制率均差异具有统计学意义(F=2749.420,171.508,均P<0.05)。SKP1干扰组细胞凋亡率低于MPP+组[(8.22±0.25)%,(15.30±0.21)%,P<0.05],而细胞抑制率低于MPP+组[(26.31±3.73)%,(55.05±3.84)%,P<0.05]。SKP1干扰+MG132组细胞凋亡率[(9.49±0.07)%]高于SKP1干扰组,细胞抑制率[(36.06±2.85)%]高于SKP1干扰组(均P<0.05)。免疫共沉淀法结果显示,SKP1免疫沉淀后,p27随之减少。结论干扰SKP1基因后,PD细胞自噬功能降低,可能与parkin促使α-syn发生泛素化,激活UBE1/parkin介导UPS通路降解α-syn,并介导P27抑制细胞凋亡有关。

胃癌组织中FBXO45和SKP1蛋白表达及其临床预后意义

为了探讨胃癌组织中FBXO45与S期激酶相关蛋白1(SKP1)蛋白表达及其临床预后意义,选取2013年5月至2014年5月该院进行胃癌手术的60例患者作为研究对象。收集其癌组织标本及对应的癌旁组织标本,并采用免疫组化染色法检测其中FBXO45与SKP1蛋白的表达水平,采用χ^2检验分析FBXO45与SKP1表达情况与胃癌临床病理特征的关系,多因素Cox回归分析探讨FBXO45与SKP1表达情况与预后的相关性。胃癌组织FBXO45、SKP1阳性表达率分别为33.33%,65.00%;癌旁组织FBXO45、SKP1阳性表达率分别为68.33%,30.00%,胃癌组织与癌旁组织中FBXO45、SKP1阳性表达比较存在明显差异(P<0.05)。TNMⅢ~Ⅳ期、低分化、出现淋巴结转移患者的FBXO45阴性表达率、SKP1阳性表达率均上升(P<0.05)。经单因素分析得出:TNMⅢ~Ⅳ期、低分化、出现淋巴结转移、FBXO45阴性表达、SKP1阳性表达的胃腺癌患者生存时间均显著缩短(P<0.05)。经多因素分析显示:TNMⅢ~Ⅳ期(HR=3.50,95%CI:2.32~5.29)、淋巴结转移(HR=3.13,95%CI:2.16~4.54)、肿瘤低分化(HR=3.76,95%CI:2.47~5.72)、FBXO45阴性表达(HR=2.69,95%CI:1.99~3.64)、SKP1阳性表达(HR=4.11,95%CI:2.51~6.74)均为影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)。FBXO45在胃癌组织中表达水平降低,而SKP1表达在胃癌组织中表达水平升高,FBXO45表达阴性与SKP1表达阳性均为胃腺癌患者预后危险因素,二者可作为判断胃癌预后的生物标志物。