基于16S核糖体RNA基因测序的苯丙酮尿症患儿肠道菌群分析

目的 基于16S核糖体核糖核酸(16S ribosomal ribonucleic acid,16S rRNA)基因高通量测序,探讨苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患儿与正常儿童肠道菌群的差异。方法 于2020年选取云南省新生儿疾病筛查中心管理的儿童为研究对象,根据儿童是否患有PKU进行分组,每入组1例PKU患儿(该组患儿均接受特殊饮食治疗),招募1~2例与PKU患儿具有相近年龄、相同居住地和户籍的正常儿童入组对照组。共纳入PKU组儿童11例,对照组儿童16例。采集两组儿童的新鲜粪便,并提取粪便DNA对16S rRNA基因V3~V4区进行高通量测序。利用BGI微生物扩增子分析平台对测序数据进行分析,并对两组儿童的肠道菌群情况进行比较。结果 PKU组和对照组儿童肠道菌群的α多样性的比较差异无统计学意义(P> 0.05),但β多样性的比较差异有统计学意义(R=0.084,P <0.05)。在门水平上,厚壁菌门和拟杆菌门为PKU组和对照组肠道菌群的优势菌门。在属水平上,拟杆菌属、粪杆菌属、毛螺菌属、芽殖菌属等菌属为PKU组和对照组肠道菌群的优势菌属。对照组中拟杆菌属和粪杆菌属的相对丰度均高于PKU组,且差异具有统计学意义(P=0.011,P=0.007)。PKU组中普氏菌属的相对丰度高于对照组(P=0.012)。结论 PKU患儿与正常儿童的肠道菌群的种类和相对丰度存在差异,该差异可能与PKU患儿接受特殊饮食治疗有很大关系,并可能影响PKU患儿的生长发育。

基于16S核糖体RNA测序研究健脾方对绝经后骨质疏松症小鼠肠道菌群的影响

目的:探讨健脾方对绝经后骨质疏松症(osteoporosis,OP)小鼠肠道菌群的影响。方法:将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组和健脾方组,每组10只。模型组和健脾方组小鼠通过双侧卵巢摘除术进行OP造模,假手术组小鼠打开腹腔后切除卵巢附近的一团脂肪组织,保留卵巢。造模后第7天,假手术组和模型组小鼠以生理盐水灌胃,健脾方组以健脾方药液灌胃(中药配方颗粒用量为54mg·kg^(-1)),3组小鼠均每天灌胃1次,每次0.2mL,连续灌胃28d。药物干预结束后,测定小鼠体质量,获取各组小鼠粪便样本、左侧股骨,切取子宫并称重,进行小鼠肠道菌群16S核糖体RNA测序分析及小鼠股骨病理学观察。结果:①一般情况。实验期间各组均无小鼠死亡。药物干预前,3组小鼠体质量的差异无统计学意义[(20.88±0.83)g,(20.65±0.74)g,(20.59±0.47)g,F=0.484,P=0.622]。药物干预结束后,模型组小鼠的体质量高于假手术组和健脾方组[(26.96±1.63)g,(23.42±0.84)g,P=0.000;(26.96±1.63)g,(24.62±1.55)g,P=0.001],假手术组和健脾方组小鼠体质量的差异无统计学意义(P=0.063)。假手术组小鼠的子宫质量高于模型组和健脾方组[(0.66±0.05)g,(0.24±0.05)g,P=0.000;(0.66±0.05)g,(0.28±0.06)g,P=0.000],模型组和健脾方组小鼠子宫质量的差异无统计学意义(P=0.053)。②小鼠肠道菌群丰度分析结果。假手术组与模型组含有499个共同操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)数据;除共同OTUs数据外,假手术组有87个特异性OTUs数据,模型组有74个特异性OTUs数据。模型组与健脾方组含有489个共同OTUs数据;除共同OTUs数据外,模型组有84个特异性OTUs数据,健脾方组有54个特异性OTUs数据。偏最小二乘法判别分析结果显示,3组小鼠肠道菌群丰度差异明显。③小鼠肠道菌群结构分析结果。物种累计曲线随样本量增加逐渐趋于平缓,说明样品中的物种已经基本被测序覆盖,测序数据量充足。3组小鼠肠道菌群相对丰度在门水平处于前4位的依次为拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、脱硫菌门,相对丰度在属水平处于前5位的依次为Muri菌属、乳杆菌属、拟普雷沃菌属、梭菌属、粪杆菌属。3组小鼠厚壁菌门、脱硫菌门相对丰度比较,总体差异均无统计学意义。假手术组和健脾方组拟杆菌门相对丰度均高于模型组(23.19±2.09,17.12±3.87,P=0.016;23.58±2.46,17.12±3.87,P=0.012)、放线菌门相对丰度低于模型组(0.32±0.29,0.79±0.31,P=0.027;0.26±0.07,0.79±0.31,P=0.014);其余各组间两两比较,组间差异均无统计学意义。3组小鼠Muri菌属、乳杆菌属、粪杆菌属相对丰度比较,总体差异均无统计学意义。假手术组拟普雷沃菌属相对丰度高于模型组(4.96±1.77,1.33±0.37,P=0.009)、梭菌属相对丰度低于模型组(0.45±0.17,1.41±0.18,P=0.000),健脾方组梭菌属相对丰度低于模型组(0.62±0.30,1.41±0.18,P=0.001);其余各组间两两比较,组间差异均无统计学意义。④健脾方组与模型组差异菌群KEGG分析结果。健脾方组与模型组有明显差异的代谢途径有维生素B6代谢、硫化物代谢、硒化物代谢、硫氨基酸代谢、硫胺素代谢、钙离子通道。⑤小鼠股骨病理学观察结果。模型组小鼠的骨小梁厚度、骨小梁数量均低于假手术组[(50.13±7.72)mm,(71.87±6.20)mm,P=0.000;(1.87±0.92)个·mm^(-1),(4.40±1.24)个·mm^(-1),P=0.000],骨小梁分离度高于假手术组[(344.60±41.32)mm,(205.80±27.21)mm,P=0.000]。健脾方组小鼠的骨小梁厚度、骨小梁数量均低于假手术组[(60.53±6.38)mm,(71.87±6.20)mm,P=0.000;(3.13±0.92)个·mm^(-1),(4.40±1.24)个·mm^(-1),P=0.002],健脾方组与假手术组小鼠骨小梁分离度的差异无统计学意义。健脾方组小鼠的骨小梁厚度、骨小梁数量均高于模型组[(60.53±6.38)mm,(50.13±7.72)mm,P=0.000;(3.13±0.92)个·mm^(-1),(1.87±0.92)个·mm^(-1),P=0.002],骨小梁分离度低于模型组[(221.40±33.16)mm,(344.60±41.32)mm,P=0.000]。结论:健脾方能够调节绝经后OP小鼠肠道菌群结构,改变代谢途径,这可能是其治疗OP的作用机制之一。

胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因(18S rDNA)扩增及序列变异初步研究

采用PCR扩增、文库构建、限制性片段长度多态性分析、序列分析和系统学分析等方法,初步研究了夏季胶州湾上层海水浮游桡足类核糖体小亚基RNA基因(18SrDNA)约1.5kb片段的序列变异。从浮游生物混合DNA中选择性扩增桡足类18SrDNA,建立桡足类18SrDNA变异类型文库,并从文库中随机挑选的30个克隆进行分析。结果表明,VspI限制性内切酶能将这些克隆分成频率分别为0.17、0.23和0.6的3种操作分类单元(OTUs),遗传多样性指数达到0.95。3条OTU代表克隆序列与甲壳纲桡足亚纲核苷酸差异数在75.4—97.8之间,而与其他亚纲的差异都高于100。3条OTU代表克隆序列均属于桡足亚纲,其中,AY437861和AY437862属于哲水蚤目。3条OTU代表克隆序列可分为2个高变异区和3个相对保守区,其GC%分别为47.37%、48.16%和48.57%。研究结果表明,混合DNA提取方法简单,设计的引物可选择性地扩增浮游桡足类18SrDNA,根据18SrDNA序列序列变异描述浮游桡足类多样性是可行的。研究结果也为在浮游桡足类分类中引入18SrDNA序列奠定了基础。

23S核糖体RNA结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G突变与儿童难治性肺炎支原体肺炎的相关性

目的 探讨23S核糖体RNA(rRNA)结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G突变与儿童难治性肺炎支原体肺炎的相关性。方法 将184例肺炎支原体肺炎患儿分为难治性肺炎组56例和非难治性肺炎组128例。比较两组患儿白细胞和中性粒细胞计数,降钙素原、C反应蛋白(CRP)、血沉、ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH)水平,以及23S rRNA结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G突变情况。分析相关指标与难治性肺炎支原体肺炎的相关性,并采用多因素Logistic回归模型分析难治性肺炎支原体肺炎的危险因素。结果 难治性肺炎组的CRP、血沉、LDH水平,中性粒细胞计数,以及A2063G和/或A2064G位点突变的比例均高于非难治性肺炎组(均P<0.05)。CRP、血沉、LDH水平,中性粒细胞计数,以及A2063G和/或A2064G位点突变情况均与难治性肺炎支原体肺炎具有相关性(均P<0.05)。Logistic回归模型分析结果显示,CRP、血沉、LDH水平升高,以及A2063G或/和A2064G位点突变均是难治性肺炎支原体肺炎的危险因素(均P<0.05)。结论 存在23S rRNA结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G突变的肺炎支原体肺炎患儿发展为难治性肺炎支原体肺炎的可能性增大,检测23S rRNA结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G的突变情况对判断肺炎支原体肺炎患儿病情和制定治疗方案具有重要意义。

胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因序列变异分析

设计了桡足类特异引物,从胶州湾浮游生物混合DNA中选择性扩增了浮游桡足类18S核糖体RNA基因片段,建立了该基因片段变异类型文库。从文库中随机选择83个克隆,对所含的18S核糖体RNA基因片段进行了V .spI和BshNIRFLP分析,发现5种操作分类单元(OTU) ,并对这些OTU的代表克隆进行了测序。分析发现获得的克隆均属于桡足亚纲。根据各OTU覆盖的克隆数计算的胶州湾浮游桡足类遗传多样性指数为0 .96。特定基因序列分析能提供易整合、易比较的多样性数据,也是建立浮游生物群落结构分子生物学剖分方法的基础和形态分类的补充。

16S核糖体RNA基因和RNA聚合酶β亚基基因及基质辅助激光解析／电离飞行时间质谱鉴定海洋副溶血性弧菌及其同源性分析的研究

目的评价16S核糖体RNA基因（16SrRNA）、RNA聚合酶β亚基基因（rpoB）及基质辅助激光解析／电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）技术对海洋副溶血性弧菌的鉴定及同源性分析的性能。方法将50株海洋副溶血性弧菌以及与其亲缘关系相近的30株海洋溶藻弧菌、8株海洋坎贝式弧菌、11株海洋哈维氏弧菌、3株海洋需钠弧菌、2株海洋创伤弧菌分别用16SrRNA、rpoB和MALDI-TOFMS技术3种方法进行鉴定并做系统进化树、聚类分析，比较分析结果。结果50株海洋副溶血性弧菌用16SrRNA鉴定出5株，rpoB鉴定出41株，MALDI-TOFMS技术鉴定出41株。16SrRNA系统进化树的结果不能将海洋副溶血性弧菌和海洋溶藻弧菌、海洋坎贝式弧菌、海洋需钠弧菌、海洋创伤弧菌分开。rpoB和MALDI．TOFMS可以准确地做出同源性分析。rpoB鉴别来自不同地域的海洋副溶血性弧菌的能力优于MALDI-TOFMS。而MALDI-TOFMS在海洋副溶血性弧菌的环境株和临床株的鉴别上优于rpoB。结论rpoB和MALDI．TOFMS技术鉴定海洋副溶血性弧菌准确，二者相结合是进行海洋副溶血性弧菌鉴定和同源性分析的适宜技术。

脑脊液细菌16S核糖体RNA基因检测在抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿中的应用价值

目的探讨脑脊液细菌16S核糖体RNA(16S rRNA)基因检测在抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿中的应用价值。方法选择化脓性脑膜炎患儿60例,在抗生素使用早期及后期采集脑脊液标本,同时进行16S rRNA基因检测及细菌培养,比较两种方法的检测阳性率,分析抗生素应用时间对两种检测方法结果的影响。结果脑脊液16S rRNA基因检测阳性21例(35.0%),脑脊液细菌培养阳性9例(15.0%),16S rRNA基因检测阳性率高于细菌培养(P<0.05)。抗生素应用早期16S rRNA基因检测阳性率略高于抗生素应用后期,但差异无统计学意义(P>0.05);抗生素应用早期脑脊液细菌培养检测阳性率高于抗生素应用后期(P<0.05)。结论对于抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿,脑脊液16S rRNA基因检出阳性率高于脑脊液细菌培养,且可能更少受抗生素应用时间的影响。

基于16S核糖体RNA高通量测序探讨加味四君子汤对严重烫伤兔肠道菌群多样性的影响

目的基于16S核糖体RNA(16S rRNA)高通量测序,探讨加味四君子汤对严重烫伤兔肠道菌群多样性的影响。方法采用实验研究方法。选取90只6~8个月龄雌雄不限日本大耳兔,按照随机数字表法分为正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组,每组18只。正常对照组兔自由饮食、饮水,单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组兔制作30%体表总面积Ⅲ度烫伤模型后分别给予生理盐水、0.2 g/mL加味四君子汤、1.0 g/mL加味四君子汤、5.0 g/mL加味四君子汤灌胃,持续给药7 d。于分组处理第1、3、7天,采用酶联免疫吸附测定法检测各组兔回肠黏膜组织中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-10水平,各组每个时间点的样本数为6。根据前述实验结果,另外选取9只兔分为正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+中剂量组,每组3只,各组兔分组及处理方法同前。于分组处理第7天,采用高通量测序技术对3组兔回肠黏膜菌群的16S rRNA V3、V4区进行测序;采用QIIME软件统计菌群优质序列数目;使用RDP Classifier软件分析菌群的门、纲、目、科、属水平;采用Illumina MiSeq测序技术对菌群行α多样性(Ace、Chao1、Simpson、Shannon指数)和β多样性分析。对数据行析因设计方差分析、SNK检验及Bonferroni校正。结果与正常对照组相比,单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+中剂量组分组处理第1、3天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高(P<0.01),单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显升高(P<0.05或P<0.01),单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著降低(P<0.01)。与单纯烫伤组相比,烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第1天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低(P<0.01),烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第1天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显降低(P<0.01),烫伤+低剂量组分组处理第7天和烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天以及烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与烫伤+低剂量组相比,烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低(P<0.01),烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与烫伤+中剂量组相比,烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高(P<0.01),烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显降低(P<0.01),烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均显著降低(P<0.01)。与第1天比较,单纯烫伤组分组处理第3、7天以及正常对照组分组处理第3天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高(P<0.05或P<0.01),单纯烫伤组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显升高(P<0.01),烫伤+低剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天和烫伤中剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显升高(P<0.05或P<0.01);烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第7天的兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),烫伤+中剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平明显降低(P<0.01),单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平明显降低(P<0.01)。与第3天比较,单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α、IL-1β水平及正常对照组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组和烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显升高(P<0.05或P<0.01),烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低(P<0.05),烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平明显降低(P<0.01)。分组处理第7天,正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+中剂量组兔回肠黏膜中的菌群分别获96023、107365、95921条优质序列。3组兔回肠黏膜中的菌群在门、纲、目、科、属的分类水平上均分别以拟杆菌门和厚壁菌门、梭菌纲和拟杆菌纲、梭菌目和拟杆菌目、瘤胃菌科和梭菌科及拟杆菌科、梭菌属和拟杆菌属及瘤胃菌属菌群为主,但各组菌群组成不同。3组兔回肠黏膜中菌群的Ace、Chao1、Simpson、Shannon指数均没有显著差异(P>0.05),β多样性无明显差异。结论严重烫伤后兔回肠黏膜炎症反应明显,并呈时间依赖性增加。加味四君子汤可减轻炎症反应,其治疗效果最佳质量浓度为1.0 g/mL。高通量测序法能够精准地反映肠道菌群的结构组成,加味四君子汤对严重烫伤后肠道菌群具有一定的调节作用。

基于16S核糖体RNA高通量测序的严重烧伤患者早期肠道菌群变化分析及代谢功能预测的前瞻性研究

目的基于16S核糖体RNA(16S rRNA)高通量测序分析严重烧伤患者早期肠道菌群变化并进行代谢功能预测。方法本前瞻性观察性研究将2018年1月—2019年12月江苏大学附属医院烧伤整形科收治的48例符合入选标准的严重烧伤患者纳入烧伤组,将同时期于江苏大学附属医院体检中心进行健康检查的符合入选标准的40名健康志愿者纳入健康组。收集烧伤组患者入院后1周左右的粪便标本及健康组志愿者体检当天粪便标本,进行16S rRNA V4区基因测序,分析各类菌属的相对丰度;应用Mothur软件进行操作分类单元(OTU)划分,分析优势菌群;通过QIIME1.9.0软件分析粪便菌群OTU数目、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数;采用Canoco Software 5.0对粪便菌群相对丰度做主成分分析;采用京都基因和基因组数据库预测粪便菌群代谢功能。对数据行独立样本t检验、Mann-Whitney U检验。结果烧伤组患者粪便中拟杆菌属、肠球菌属、不动杆菌属、巨球型菌属、葡萄球菌属相对丰度明显高于健康组志愿者(Z=-5.20、-2.37、-5.17、-4.41、-6.03,P<0.05或P<0.01),而健康组志愿者粪便中未分类的毛螺杆菌科、普氏菌属、盲杆菌属、未分类的瘤胃球菌科、假丁酸弧菌属、布劳特菌属、未分类的消化链球菌科(Z=-8.03、-3.21、-7.63、-5.88、-8.05、-8.05、-6.77,P<0.01)等19种菌属的相对丰度明显高于烧伤组患者。健康组志愿者粪便菌群多样性优于烧伤组患者,其主要优势菌群为拟杆菌属、未分类的毛螺杆菌科、普氏菌属、未分类的肠杆菌科、布劳特菌属、副拟杆菌属和大肠志贺杆菌属等,而烧伤组患者粪便主要优势菌群为拟杆菌属、普氏菌属、未分类的肠杆菌科和副拟杆菌属。烧伤组患者粪便菌群OTU数目、Ace指数、Chao1指数、Shannon指数分别为(149±47)个、199±45、190±45、2.0±0.9,显著少/低于健康组志愿者的(266±57)个、323±51、318±51、3.8±0.5(t=10.325、11.972、12.224、11.662,P<0.01)。健康组志愿者和烧伤组患者粪便菌群相对丰度在主成分1被清晰地区分为2个群体,主成分1贡献率为32.50%,P<0.01;健康组志愿者粪便菌群在主成分2上较为集中,烧伤组患者粪便菌群在主成分2上散布较大,主成分2贡献率为13.44%,P>0.05。烧伤组患者粪便菌群氨基酸中丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸、精氨酸-脯氨酸、半胱氨酸-蛋氨酸、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸以及碳水化合物中三羧酸循环、果糖和甘露糖、半乳糖、酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢水平显著低于健康组志愿者(Z=-4.75、-4.54、-4.75、-4.62、-3.71、-3.28、-4.19,-3.82、-4.72、-4.35、-4.75、-4.71,P<0.01),硫辛酸代谢和辅酶Q合成水平明显高于健康组志愿者(Z=-6.07、-4.51,P<0.01),花生四烯酸代谢水平与健康组志愿者相近(P>0.05)。结论基于16S rRNA高通量测序得出,严重烧伤患者早期肠道菌群和健康人群存在明显差异,烧伤患者肠道菌群种类减少,多样性降低,营养代谢水平降低。

基于16S核糖体RNA高通量测序的特重度烧伤患者肠道菌群动态变化分析

目的基于16S核糖体RNA(rRNA)高通量测序分析特重度烧伤患者肠道菌群的动态变化规律。方法本前瞻性观察性研究纳入2017年2—6月中国科学院大学宁波华美医院收治的符合入选标准的5例男性特重度烧伤患者(年龄32~48岁),采集其休克期(伤后3 d内)、急性感染早期(伤后4~14 d)、急性感染中期(伤后15~28 d)、急性感染后期(伤后29 d至出院前1周)及出院前1周内的粪便样本,各时期样本数均为5。使用pH计测定粪便样本的pH值,高通量测序技术对粪便样本的16S rRNA V3、V4区进行测序。QIIME分析软件分析肠道菌群操作分类单元(OTU)数目、α多样性(Chao1指数、Shannon指数)和门、科的相对丰度,非加权组平均法聚类分析肠道菌群β多样性,Tax4Fun预测肠道菌群功能变化。对数据行单因素重复测量方差分析、Bonferroni法、配对样本Wilcoxon秩和检验及Bonferroni校正。结果(1)本组特重度烧伤患者急性感染早、中期粪便pH值分别为7.40±0.45、7.56±0.45,明显高于休克期的6.68±0.36(P<0.05或P<0.01)。(2)共获得2333584条有效高质量序列,序列长度为415 bp左右,共获得1209个OTU,所有标本测序覆盖度均达99.0%以上。本组特重度烧伤患者急性感染早、中、后期OTU数目、Chao1指数明显低于休克期(Z值均为2.023,P<0.05);出院前1周内OTU数目、Chao1指数明显高于急性感染早、中、后期,Shannon指数明显高于急性感染早、中期(Z值均为2.023,P<0.05)。(3)本组特重度烧伤患者休克期样本菌群结构与出院前1周内相似度高,与急性感染早、中、后期相似度低。各个单独样本的分析显示,大部分样本聚类规律与分期样本一致。休克期肠道菌群加权Unifrac距离明显短于急性感染早、中、后期(Z=3.326、2.570、2.690,P<0.05或P<0.01),其他时期肠道菌群加权Unifrac距离相近。(4)门水平上,与休克期比较,急性感染早、中、后期厚壁菌门细菌相对丰度降低,变形菌门和拟杆菌门细菌相对丰度升高;上述3个菌门细菌相对丰度在出院前1周内与休克期相近。伤后不同时期科水平上相对丰度前5的优势菌有较大差异,休克期的前5优势科细菌相对丰度在急性感染早、中、后期降低。休克期的非优势科如肠杆菌科、链球菌科、拟杆菌科细菌相对丰度在急性感染早、中、后期大幅升高,成为这些时期新的优势科;出院前1周内部分产酸菌科细菌相对丰度恢复至接近休克期水平。(5)急性感染早、中期肠道菌群的某些氨基酸代谢、糖酵解和糖异生、丙酮酸代谢等功能较休克期减弱,急性感染后期肠道菌群某些氨基酸和糖类代谢较休克期增强,休克期与出院前1周内肠道菌群功能基因分布相似。结论特重度烧伤患者肠道内环境及菌群结构在急性感染早、中期发生了明显变化,pH值升高,菌群种类及多样性减少,尤其是产酸菌科细菌的相对丰度明显降低,但随着患者治疗结束而恢复。可考虑将粪便pH值和肠道变形菌门及产酸菌科细菌变化作为反映特重度烧伤患者肠道菌群紊乱水平的指标。

新疆柔叶真藓居群18S核糖体RNA基因序列分析

柔叶真藓(Bryum cellulare Hook.)是真藓属植物。目前对分布在新疆阿尔金山国家级自然保护区不同地理居群的柔叶真藓遗传多样性研究还未见报道。本研究以采自于该保护区四个不同地理居群的柔叶真藓为样品对其18S核糖体RNA基因(18S r DNA)序列进行分析。结果表明:样本测序拼接完成后的序列长度在1 712~1 761 bp之间,进行空位剪切及比对后长度为1 698 bp。整个序列中有三个碱基位置上的差异,其中变异位点有12个,A、T、C、G的平均含量比率分别为24%、27%、23%、26%。再通过从NCBI的Gen Bank进行同源性搜索得到的相似性序列均属于真藓属,增大了序列的可靠性。将与其序列结合检测遗传距离及构建系统进化树,进行同源性分析可知,这种差异由于18S核糖体RNA基因序列本身的特性,表明种群的遗传距离与地理环境和位置有一定的相关性,其中在环境的变化及变异的可能性对四个不同地理居群的柔叶真藓植物有影响。

某院儿童肺炎支原体感染情况及23S rRNA基因位点突变与抗生素耐药的相关关系

目的分析某院儿童肺炎支原体感染情况及23S rRNA基因位点突变与抗生素耐药的相关性。方法选取2021年2月至2023年1月在浙江省长兴县中医院就诊的100例疑似肺炎支原体感染患儿,对比不同性别、年龄儿童肺炎支原体的感染情况。根据基因检测结果,将患儿分为突变组和非突变组,并对比2组患儿的临床资料,采用多因素Logistic回归分析影响耐药突变的相关因素。结果100例疑似肺炎支原体感染患儿中,92例(92.0%)PCR检测结果为阳性;其中23S rRNA基因位点突变36例(39.1%),未突变56例(60.9%)。女性患儿的肺炎支原体阳性率(93.2%)稍高于男性(91.1%),且23S rRNA基因位点突变率(41.5%)稍高于男性(37.2%),但差异无统计学意义(P>0.05)。>3岁患儿的肺炎支原体阳性率(96.8%)高于1~3岁患儿(83.8%),且23S rRNA基因位点突变率(47.5%)高于1~3岁患儿(22.6%)(P<0.05)。突变组和未突变组患儿的白细胞计数、嗜中性粒细胞百分比、降钙素原、红细胞沉降率、发热持续时间、咳嗽持续时间、住院时间、本次病程大环内酯类药物应用时间、本次病程肺炎支原体-DNA载量等相比,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,本次病程肺炎支原体-DNA载量与耐药突变相关(P<0.05)。结论肺炎支原体23S rRNA基因位点突变风险随着肺炎支原体肺炎患儿年龄的增加而逐渐升高。此外,本次病程肺炎支原体-DNA载量与V区A2063G和A2064G耐药突变相关。

海链藻目核糖体RNA基因片段的扩增及多样性分析

海链藻目(Thalassiosirales)的海链藻属(Thalassiosira)和骨条藻属(Skeletonema)微藻是形成春季赤潮的主要种类。为利用分子生物学方法分析表层海水主要赤潮形成藻的动态变化、快速鉴定赤潮形成藻种,设计了海链藻目特异引物,扩增了胶州湾近岸表层海水海链藻目18S核糖体RNA基因片断。随机测定10个序列,其中4个与海链藻属的Thalassiosi-ra concaviuscula的完全相同,其余的可确定属于海链藻属。表明该引物对能选择性地扩增海链藻目18S核糖体RNA基因片断。

小鲵科线粒体16S rRNA基因序列分析及其系统发育

To study the phylogeny of Hynobiidae, we amplified DNA fragments of 470 bp 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene on mitochondrial DNA from Ranodon sibiricus and Ranodon tsinpaensis. PCR products were cloned into PMD18 T vector after purification. These sequences were determined and deposited in the GenBank (accession numbers: AY373459 for Ranodon sibiricus, AY372534 for Ranodon tsinpaensis). By comparing the nucleotide differences of 16S ribosomal RNA sequences among Liua shihi,Pseudohynobius flavomaculatus and Batrachuperus genus from GenBank database,we analyzed the divergences and base substitution among these sequences with the MEGA software. The molecular results support that B tibetanus, B pinchonii and B karlschmidti are classified into three valid species. Liua shihi has closer phylogenetic relationships to Ranodon tsinpaensis than to other species. More our results reveal that Pseudohynobius flavomaculatus is not a synonym of Ranodon tsinpaensis. .

基于COI和16SrRNA基因的地龙药材及其混淆品的DNA条形码鉴定

目的利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COI)和16S核糖体RNA(16SrRNA)对地龙药材及常见混伪品进行分子鉴定,探讨快速、准确鉴定地龙药材及其混伪品基原物种的方法。方法收集地龙药材的药典收载品种及其易混品种10种,提取DNA,得到其COI和16SrRNA序列。所得序列经DNAStar校正后,用MEGA6.0自带的Clustal W多重比对,除去冗余位点,比对结果经MEGA6.0分析,构建地龙药材及其混淆品的邻接(N-J)树。结果地龙药材的正品来源参环毛蚓(Pheretima aspergillum)、通俗环毛蚓(P.vulgaris)、威廉环毛蚓(P.guillelmi)及栉盲环毛蚓(P.pectinifera)与其混淆品种间COI和16SrRNA基因序列均存在较多变异位点。由所构建的N-J系统聚类树图显示所测物种的单系性,即16SrRNA、COI可以很好的将地龙药材区别于其他混伪品。结论所获得的COI和16SrRNA序列可作为不同状态的地龙类药材物种鉴定的分子依据,并为进一步建立地龙等动物类中药物种真实性鉴定体系奠定了重要的实验基础。

土壤细菌16SrRNA基因变异型及其与植被的相关研究

绕过细菌的分离培养 ,直接提取土壤DNA ,扩增、克隆土壤细菌群体的 16S核糖体RNA基因 (16SrD NA) .根据该基因各种变异类型的限制性片段长度多型性 ,分析土壤细菌分子遗传多样性及其与植被的相互关系 .植被的改变影响土壤养分 ,进而改变土壤细菌群落结构 .土壤细菌遗传多样性和分化能反映植被的变化 .

败血支原体16S rRNA基因的克隆与核酸序列分析

从败血支原体Ｄ９６０４株培养物中直接快速提取染色体ＤＮＡ；构建了ＭＧ基因文库，以ＰＣＲ扩增１６ＳｒＲＮＡ基因全长片段，并对其进行了核苷酸序列分析。结果表明，Ｄ９６０４株与Ａ５９６９株只有５个核苷酸的差异，同源性为９９．６７％。

拟南芥18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径的研究

通过筛选以拟南芥蓝光受体隐花色素双突变体cry1cry2为遗传背景的激活标签突变体库,得到一株SCC98-D株系,该突变体具有早开花,下胚轴变短,并具有花瓣数目增加等表型,彻底恢复了cry1cry2的晚开花和长下胚轴表型.通过Tail-PCR的方法克隆得到SCC98-D突变体中激活标签插入位点的侧翼序列,通过对该侧翼序列测序发现插入位点在18srRNA的1751bp处,运用RT-PCR方法分析插入位点周围基因的表达,发现只有18srRNA的表达被激活,由此证实了18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径.

基于16S rRNA检测分析宫颈癌患者放射治疗前后肠道菌群变化特征

目的:探究电离辐射对宫颈癌患者肠道菌群的影响特点及菌群变化与放射性肠炎发生的相关性。方法:选取福建医科大学附属泉州第一医院2019年1月至2020年1月收治的30例宫颈癌患者,在其调强放射治疗的不同时间点收集其粪便样本,分析肠道微生态的生物标志物,用MoBio PowerSoil试剂盒提取肠道菌群DNA,用MiniSeq对肠道菌群16S rRNA的V4区进行测序及生物信息学分析。差异度采用Wilcoxon秩和检验等分析。结果:宫颈癌患者放射治疗后肠道微生物群的α多样性比放疗前高,同时放疗前后微生物群落组成(即β多样性)存在一定差异,但差异均无统计学意义(P>0.05);但是在宫颈癌患者放疗后微生物组成中普雷沃氏菌和链球菌较放疗前有显著变化(P<0.05)。结论:宫颈癌患者放疗前后微生物成分存在差异,但有待大规模的前瞻性队列研究证实。

16S rRNA基因序列分析在人体微生物组学研究中的进展及应用

在人体表面以及与外界相通的腔道中,如皮肤、胃肠道、鼻腔等部位,定植着大量以细菌为主的微生物群落。这些微生物的数量可达人体自身细胞数的10倍以上,其基因数量更多达人体基因数的100多倍〔1〕。微生物群落在人体内维持一定的动态平衡,参与调节人体的一系列生理生化反应,如免疫调节、食物消化、维生素合成等。因此,微生物群落的平衡失调可能导致各种感染性、过敏性疾病甚至肿瘤的发生。人体微生物组的概念最早在2001年提出,是对人体共栖。