猪传染性胃肠炎病毒南京株纤突S蛋白基因的克隆与序列分析

参考 Genbank收录的 TGEV- Miller株的基因序列 ,自行设计合成 1对引物 (TGEVP5 /P6 ) ,对不同代次的 TGEV疫苗弱毒 STC3及种毒 、种毒 进行了 RT- PCR扩增 ,产物经琼脂糖凝胶电泳分析 ,均出现 1条大约 12 6 2 bp的目的条带 ,经 Eco R 酶切 ,都产生了 871bp和391bp左右的两个片段 ,与预期大小相符。将种毒 RT- PCR扩增目的条带回收纯化后克隆入PMD18- T载体中 ,转化宿主菌 DH5 α,挑选阳性克隆 (命名为 PTs) ,提取重组质粒 ,用 Hpa 、Eco R 对重组质粒进行酶切鉴定以及 PCR扩增 ,然后进行序列测定 ,并进行了序列分析 ,证实与国外标准毒株 Miller、Fs772 / 70、Purdue。

1994—2009年我国部分地区37株鸡传染性支气管炎病毒S蛋白基因序列分析

对自1994—2009年从我国5省区免疫鸡群中分离到的37株传染性支气管炎病毒(IBV)的S蛋白基因序列进行分析,发现S1基因序列存在广泛的氨基酸替换、缺失和插入现象,大部分IBV分离株S1基因的推导氨基酸序列变异主要集中在60～63、73～74、97、128、282～299位等。S2基因较为保守,主要在裂解位点后的2～47、122～152位发生氨基酸的替换,可见IBV S基因的不断变异可能是造成本试验所调查的5省区免疫鸡群IB频发的重要原因。遗传进化分析发现本试验所调查地区近十多年来肾型毒株仍是主要流行株,没有或少有4/91型毒株流行。所调研地区鸡的腺胃炎持续广泛地发生,但是从临床腺胃病料中很少分离到IBV,可见IBV不太可能是引起腺胃炎的主要病原。

荞麦属种间13S球蛋白基因序列比较研究

荞麦13S球蛋白是荞麦种子中的一类主要贮藏蛋白。本研究选用荞麦属植物甜荞栽培种及其野生类型、苦荞栽培种及其野生类型、毛野荞、左贡野荞、细柄野荞和硬枝万年荞6个种共44份材料,进行PCR特异性扩增、测序得到荞麦13S球蛋白基因的保守片段序列。对序列进行差异分析,结果发现44份供试材料13S球蛋白基因片段的285个排列位点中不变位点为24个,多态性位点S为261个(含简约信息位点数198个和单型可变位点63个),序列总突变位点Eta为503个。野生甜荞种内13S球蛋白基因序列差异明显高于栽培甜荞,但野生苦荞种内13S球蛋白基因序列差异仅稍高于栽培苦荞。推测其一方面可能与繁殖方式有关,另一方面可能与荞麦驯化过程中通常只有少数野生型群体被驯化有关。系统聚类分析发现栽培甜荞与野甜荞亲缘关系近,与左贡野荞亲缘关系次之;栽培苦荞与野苦荞亲缘关系近,与毛野荞亲缘关系次之;细柄野荞和硬枝万年荞的13S蛋白基因片段序列差异较小,说明其亲缘关系较近。上述结果为荞麦属种间遗传多样性与进化关系研究提供了理论依据。

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA。参照IBVBeaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT-PCR,成功地扩增出IBVH株S1基因。扩增产物经BstYⅠ、HaeⅢ和PstⅠ酶切分析,结果表明,IBVH株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBVH株为Mass血清型。将IBVH株S1基因克隆于pGEM-T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97.39%和97.27%。将IBVH株S1基因亚克隆到pPICZ-A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS-PAGE实验证实了IBVH株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测,证实了表达产物的抗原特异性。

乙肝表面抗原小蛋白S基因导入番茄的遗传转化体系的建立

以丽春番茄无菌苗的子叶为外植体,以农杆菌菌株EHA105(包含质粒pBin438S)为载体,将乙肝表面抗原小蛋白S基因导入番茄组织中.基本培养基采用MS+6-BA1 0mg/L+IAA0 2mg/L,在共培养时加入乙酰香酮100μmol/L作为诱导剂,经过组织培养得到转基因植株.对转化植株基因组进行的分子学PCR检测表明,外源基因有可能已整合到番茄基因组中.该转基因遗传体系的建立为利用转基因植物生产乙肝口服疫苗奠定了基础.

SARS病毒S蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的 克隆传染性非典型肺炎 (SARS)病毒纤突蛋白S氨基端编码序列 ,并将其置于大肠杆菌作融合表达 ,为快速检测SARS病人IgM提供抗原。方法 从GenBank获得SARS病毒BJ0 1株纤突蛋白S基因序列 ,人工合成其氨基端 5 0 1bp双链DNA序列 ,在 5’和 3’端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点。常规法将其克隆到 pBluescriptⅡSK(+)质粒中进行核酸序列测定 ,进一步将其克隆进原核表达载体pGEX 6 p 1中 ,构建含S蛋白基因的重组原核表达质粒。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌 (E .coli)BL2 1感受态细胞 ,以异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达融合蛋白。结果 核酸序列测定与分析的结果表明 ,克隆的 5 0 1bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ0 1毒株序列呈现 10 0 %同源性。IPTG诱导后的菌体 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ,显示有一个大小为 4 2ku的融合表达蛋白产生。结论 S蛋白氨基端 5 0 1bp编码基因在E .coli中获得正确表达 ,为进一步研究提供了实验室资料。

S7核糖体蛋白基因片段序列变异与花鲈属鱼类系统发育研究

对中国和日本海域花鲈属的3个种:花鲈(Lateolabrax maculatus)、鲈鱼(L. japoni-cus)和高体鲈(L. latus)的S7核糖体蛋白基因片段序列进行了扩增和序列测定,分析比较了3个种23个个体间的序列差异。在456bp的S7核糖体蛋白基因片段中,3个高体鲈个体中出现了3种单倍型,种内个体间有2个碱基差异;7个花鲈个体中出现了7种单倍型,种内个体间有21个碱基差异;13个鲈鱼个体中出现了12种单倍型,种内个体间有22个碱基差异。结果表明,花鲈属S7核糖体蛋白基因片段序列具有丰富的遗传信息,在亲缘关系较近的物种间也存在显著的序列差异,基于S7核糖体蛋白基因片段序列的NJ和ME系统树经1000次重复抽样检验后得到相似结果,表明S7基因内含子2是适合于研究分子系统发育的分子标记。利用Modeltest选取最佳核苷酸替代模型构建的NJ树表明:花鲈属鱼类由高体鲈分化,花鲈与鲈鱼的亲缘关系很近,而与高体鲈的亲缘关系较远。

基于S7核糖体蛋白基因部分序列的10种石鲈科鱼类的系统发育关系

分析了石鲈科4属10种鱼类S7核糖体蛋白基因内含子1部分序列特征,采用MP法和NJ法构建系统发育树。结果表明,在分子系统树上,10种石鲈科(Haemulidae)鱼类共组成两大类群,其中髭鲷属(Hapalogenys)鱼类和胡椒鲷属(Plectorhynchus)鱼类聚成一类群,石鲈属(Pomadasys)鱼类和仿石鲈属(Haemulon)鱼类聚成一类群,两类群再聚成一支,10种石鲈科鱼类构成单一分支类群。髭鲷属鱼类跟胡椒鲷属鱼类的亲缘关系较近。基于遗传距离分析表明,相对于石鲈属,髭鲷属鱼类跟仿石鲈属鱼类的遗传距离较小。因此,研究结果支持髭鲷属的分类地位是介于胡椒鲷属和仿石鲈属之间,未能从石鲈科中独立出来形成髭鲷科(Hapalogeniidae)。

基于S7核糖体蛋白基因部分序列的7种金线鱼属鱼类分子系统进化关系

测定了7种金线鱼属(Nemipterus)及2种锥齿鲷属(Pentapus)鱼类S7核糖体蛋白基因(S7基因)内含子1部分序列,以二线眶棘鲈(Scolopsis bilineatus)做为外类群初步探讨了其分子进化关系。测序所得S7部分序列为734-746 bp,序列比对后得到同源序列743 bp。其中保守位点386个,变异位点351个,简约性信息位点289个。A+T含量(54.1%)高于G+C含量(45.9%)。基于Kimura 2-Parameter模型计算出7种金线鱼的遗传距离为0.042-0.294。S7序列存在大量碱基插入与缺失,其中日本金线鱼(Nemipterus japonicus)与苏门答腊金线鱼(N.mesoprion)在第167、182、474、608、662 bp位置,金线鱼(N.virgatus)与印度洋金线鱼(N.bipunctatus)第227、332、401、604 bp的位置具有相同的碱基插入缺失特征,且具有种类特异性。最后利用最大似然法(ML)与贝叶斯分析(BI)构建分子系统进化树,7种金线鱼聚在一起,其中日本金线鱼与苏门答腊金线鱼聚为一支,金线鱼、深水金线鱼和印度洋金线鱼聚成一支。结论认为需要结合多方面的形态与分子证据,才能进一步明确金线鱼属鱼类的系统进化关系。

粘虫核糖体蛋白S11基因cDNA的克隆和序列分析

【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。

S7核糖体蛋白基因序列变异与亚科鱼类的单系性研究

使用分子生物学的方法对亚科鱼类的单系性进行了探讨。通过PCR方法 ,获得了 13种鲤科鱼类S7核糖体蛋白基因第 1内含子序列 ,其中包括 6种亚科鱼类。使用MEGA软件中的Neighbor Joining法和Most Parsimony法分别构建分支系统图。研究结果显示目前所确认的亚科鱼类实际上没有形成单系类群。其中属、波鱼属和低线属位于系统树基部 ,显示出原始性。而由细鲫属、马口鱼属和属构成的类群相对于亚科中的原始种类起源较晚 ,可能和较晚起源的东亚鲤科类群之间有更为密切的关系。

柞蚕核糖体蛋白基因S3a的克隆及表达分析

核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。

水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S6的表达和抗血清的制备

经RT-PCR扩增出水稻矮缩病毒(RDV)中国分离物非结构蛋白基因S6,并克隆至pGEM-Teasy载体上。序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子。将S6基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达。以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔,制备抗S6蛋白的抗血清,ELISA测定表明,该血清与抗原共价特异性反应,抗血清的效价为1:3000.Western blot印迹实验表明该抗血清能特异性检测RDV感染的水稻组织中的S6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分子手段。

基于S7核糖体蛋白基因部分序列的石鲈属鱼类分子系统进化关系

基于核DNA分子标记S7核糖体蛋白基因内含子1部分序列对分布于南海及美洲,非洲,大洋洲等周边海区的石鲈属鱼类11种,结合石鲈亚科其他属如仿石鲈属,异孔石鲈属,八带石鲈属及锯鳃石鲈属等21种鱼类的系统进化关系进行了研究分析。利用最大简约法以及贝叶斯法构建了系统进化树。进化树上,石鲈属的种类并没有形成一个单系,除了大斑石鲈,断斑石鲈等6种石鲈属鱼类聚成一石鲈属的分支外,其他石鲈属种类都位于进化树的不同位置。侧扁石鲈与八带石鲈聚在一起,大棘石鲈与异孔石鲈属聚在一起。红海石鲈与纵带石鲈与仿石鲈属的种类关系较近,佩氏石鲈最先分化出来,位于整个石鲈亚科分支基部。该分类关系与其各自的地理分布情况有着一定的联系。

天祝白牦牛α_(S1)-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因(TaRPL8),探索其应用前景。方法用RT-PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPL8基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPL8基因可在大肠埃希菌BL21/DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。

IBV青岛腺胃分离株S1纤突蛋白基因的克隆与鉴定

参考Genebank发表的传染性支气管炎病毒 (IBV)S1纤突蛋白基因序列 ,自行设计合成了 1对引物 ,对IBV青岛腺胃分离株 (SD/97/0 2 )RNA进行RT PCR扩增。产物经琼脂糖凝胶电泳分析 ,呈现 1条 16 5 7bp的条带 ,将其克隆入pMD18 T载体中 ,并进行序列测定 ,证实为S1基因。将此重组质粒命名为pMDQXS1。

拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体(S)原核表达及多克隆抗体制备

利用原核表达获得的拟蜘蛛牵丝蛋白制备多克隆抗体,将为我们在真核水平检测其表达情况奠定基础。以质粒pGEX-2T为骨架载体,在其多克隆位点处连接人工合成的拟蛛丝蛋白基因单体(S),构建含有GST标签的融合蛋白原核表达载体pGEX-S;利用IPTG诱导重组质粒pGEX-S在大肠杆菌感受态细胞BL21中表达,并利用GST标签亲和纯化重组蛋白,获得的S-GST蛋白与佐剂混合后,采用多点皮下免疫注射8只健康的CDⅠ小白鼠,免疫期结束后收集抗血清进行ELISA检测。序列分析后,确定原核表达载体pGEX-S编码正确;诱导表达后,Western blot检测显示在41 kD处有重组蛋白条带出现,与我们预期的结果相符;抗血清Elisa检测显示有2只小鼠A和F抗血清效价较高。采用原核表达生产的拟蜘蛛牵丝蛋白成功制备了多克隆抗体。

大豆11S球蛋白基因Gy1启动子克隆及序列分析

以高蛋白大豆品种南农87C-38总DNA为模板,采用PCR法扩增获得约1100bp大小的DNA片段,回收该片段并克隆到pUCm-T载体上,选取阳性克隆进行PCR和酶切检测,再进行测序分析.序列分析显示该片段含1174个核苷酸,采用Vector NTI软件将试验中克隆的序列与GenBank E07850报道的Gy1启动子和GenBank X15121报道的Gy1启动子及信号肽对应序列分别进行比对,同源性分别为99.6%和99.3%,确定该片断为南农87C-38大豆11S球蛋白基因Gy1启动子及信号肽.该启动子的成功克隆,可为今后利用基因工程技术改良大豆种子营养品质研究奠定基础.

组织蛋白酶S基因启动子区-25G/A多态不是中国人群中冠心病的预测因子

目的这项研究的目的旨在观察中国人群中,组织蛋白酶S(CTSS)基因-25G/A多态分布及其多态性与冠心病(CAD)危险性之间的关联。方法CTSS基因-25G/A多态性由多聚酶链式反应PCR及限制性内切酶降解方法获得。经冠脉造影检查明确的共659名冠心病患者(冠脉狭窄≥50%)及352名非冠心病患者(对照组)纳入这项研究。结果所有研究对象中的等位基因G和A的频率分别为0.630及0.370。在病例组及对照组之间未发现其CTSS-25G/A多态性频率(G:0.626 vs.0.633,P>0.05;A:0.374 vs.0.367,P>0.05)及基因型分布(G:83.4 vs.85.3,P>0.05;A:58.0 vs.58.5,P>0.05)存在显著性差异。使用逻辑回归对其他危险因素校正后,CTSS基因型与冠脉狭窄严重程度之间亦未发现存在关联(P>0.05)。结论在中国人群中,基因型AA较基因型GG和GA更为少见。对照组及冠心病组之间的等位基因频率及基因型分布均无显著性差异。CTSS- 25G/A多态性与冠状动脉狭窄的发生率及严重程度不相关。