番茄、拟南芥和葡萄中同型半胱氨酸S-甲基转移酶基因家族功能研究

同型半胱氨酸S-甲基转移酶(homocysteine S-methyltransferase,HMT)普遍存在于被子植物中,在植物合成甲硫氨酸过程中起着重要作用,其在拟南芥中的功能已有所研究,但该家族在其他植物中的功能尚不清楚。本文通过同源比对,获取番茄、拟南芥和葡萄中共8个HMT家族基因的信息,通过系统进化树分析,发现8个HMT蛋白形成2个分支;利用蛋白motif分析、蛋白结构域分析、基因外显子内含子结构分析,发现HMT蛋白在进化上较为保守。通过对拟南芥在非生物胁迫条件下HMT家族基因的表达水平进行分析,发现多个AtHMT基因对非生物胁迫尤其是冷胁迫、盐胁迫、干旱胁迫产生应答,表明HMT家族基因在非生物胁迫应答中的调控作用。另外,通过对番茄各组织在发育的各个阶段中HMT基因进行表达量分析,发现HMT基因可能在番茄种子发育、开花、果实成熟方面发挥作用。综上,本文对番茄、拟南芥和葡萄中HMT基因家族的生物信息学分析及基因表达数据进行了挖掘,对深入研究HMT基因在番茄、拟南芥和葡萄中的作用具有重要意义。

一种S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶活性的检测方法

通过PCR扩增获得了S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(SAHN)和S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的基因序列,克隆入表达载体,转化宿主细胞,表达纯化得到带有组氨酸标签的重组蛋白,基于SAHN和SRHH重组酶建立了一种酶偶联分析S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶活性的检测方法.甲基转移酶的共同产物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)首先被SAHN酶水解生成腺嘌呤和S-核苷高半胱氨酸,后者进一步被SRHH酶裂解生成高半胱氨酸,最后高半胱氨酸与Ellman’s试剂反应生成5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB).实验结果表明,重组表达获取的2种酶蛋白均具有良好的催化活性,酶偶联反应生成的TNB与初始AdoHcy浓度呈现显著的线性正相关.该检测方法克服了S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶的共同产物AdoHcy的反馈抑制,使甲基化反应进行完全,从而保证了对甲基转移酶活性准确有效的定量分析.

S-同型半胱氨酸甲基转移酶活性检测和保存方法的建立

目的建立一种简单的S-同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT)活性测定方法,确定HMT的最佳使用条件,并初步探索HMT的保存方法。方法采用原核表达系统制备HMT,经镍亲和层析和Sephadex G15两步纯化。SDS-PAGE对目的蛋白进行理化性质鉴定。基于5,5′-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)可以特异性地与含有巯基的化合物快速发生化学反应的原理,通过检测同型半胱氨酸的减少量来计算酶活性,确定HMT最佳活性测定条件。比较添加和不添加甘油的两组HMT酶液置于不同温度下保存,定期测定活力;在HMT酶液中加入不同浓度的不同保护剂,比较冷冻干燥后的活性保留率。结果重组表达的酶纯度高达95%以上,相对分子质量为36 000,具有良好的催化活性,比活为2 000U/mg。在37℃、pH7.4的HEPES缓冲液中反应25min为酶活性测定最佳条件。加入甘油能明显延长酶的保存时间并且酶液在6个月内的活力保留一半。冷冻保护剂甘露醇和海藻糖的添加对HMT酶冻干品的酶活保留率分别为104.0%和100.0%。结论通过基因工程技术获得HMT,建立了简单的HMT活性测定方法,并确定了该酶的最佳保存方法,为临床应用奠定了基础。

沼泽红假单胞菌砷(Ⅲ)S-腺苷甲基转移酶的初步晶体学分析

含砷化合物有高毒性,一直是全球性的公共卫生难题。许多微生物能利用S-腺苷甲基转移酶(ArsM酶)催化有剧毒的无机As(Ⅲ)发生甲基化而解毒。为揭示酶促反应的真实机制,我们将来源于沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonas palustris)的ArsM酶(RpArsM)重组表达、纯化及结晶。在上海光源BL17U1线站收集蛋白晶体衍射数据,初步晶体学分析表明,RpArsM酶的晶体属于P212121空间群,晶胞参数分别是a=45.92,b=66.58,c=147.82,α=β=γ=90°,衍射分辨率达2.0。

外周血前列腺癌基因3基因联合甲基化谷胱苷肽S-转移酶P1基因在前列腺癌诊断中的意义

目的研究前列腺癌(PCa)和前列腺增生(BPH)患者及健康者血清中前列腺癌基因3(PCA3)基因和甲基化胎盘型谷胱苷肽S-转移酶P1(GSTP1)的表达情况,探讨PCA3基因联合甲基化GSTP1基因作为前列腺癌早期诊断的价值。方法随机选取80例PCa患者为PCa组、120例BPH患者为BPH组和100例健康男性志愿者为对照组为研究对象,均采用RT-PCR技术分别检测外周血前列腺癌基因3(PCA3)基因和甲基化GSTP1基因在血清中表达水平化表达情况,并进行对比分析。结果 PCa组血清中PCA3基因和甲基化GSTP1基因浓度均明显高于BPH组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05);BPH组和对照组血清中PCA3基因和甲基化GSTP1基因浓度均无差别,差异无统计学意义(P>0.05)。PCA3基因和甲基化GSTP1基因诊断PCa其敏感度分别为72.5%(58/80)、85.0%(68/80),特异度分别为87.5%(70/80)、77.5%(62/80);而联合检测时其敏感度可增至95.0%(76/80),特异度为90.0%(72/80)。结论外周PCA3基因和甲基化GSTP1基因检测都是PCa诊断的良好指标,PCA3基因联合甲基化GSTP1基因检测可弥补PCA3基因敏感性低和甲基化GSTP1基因特异性低的缺点,更有利于早期PCa诊断。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因及甲硫氨酸合成酶基因多态性与口服叶酸治疗高同型半胱氨酸血症疗效的关系研究

目的分析亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶基因(MTR)多态性与口服叶酸治疗高同型半胱氨酸血症(HHcy)疗效的关系及基因与环境在治疗效果中的交互作用。方法选取2014年6—9月于郑州大学第五附属医院神经内科检查血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平的住院HHcy患者515例为研究对象。常规治疗基础上给予口服叶酸(5 mg/d)治疗90 d。治疗中期(叶酸补充45 d)行第1次电话随访,治疗结束(叶酸补充90 d)行第2次电话随访,督促患者遵循医嘱服药,并在治疗结束后到医院复查血浆Hcy水平。按照复查血浆Hcy水平将患者分为失败组(Hcy≥15.0μmol/L)和成功组(Hcy<15.0μmol/L)。收集患者的基线资料,选取MTHFR上2个单核苷酸多态性(SNP)位点和MTR上1个SNP位点,分别为:rs1801133、rs1801131和rs1805087;采用Sequenom公司的时间飞行质谱生物芯片系统(Mass Array系统)检测基因分型和等位基因,采用多因素降维法(MDR)分析基因-环境交互作用。结果随访结束后,剔除服药依从性差或者失访患者131例,剔除两次服药依从性均一般的患者125例,剩余259例。其中失败组115例,成功组144例。失败组患者糖尿病病史发生率、高血压病史发生率、冠心病病史发生率、基线血浆Hcy水平均高于成功组(P<0.05)。成功组3个SNP位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(rs1801133:χ2=0.11,P=0.170;rs1801131:χ2=0.00,P=1.000;rs1805087:χ2=0.01,P=0.860)。单因素非条件Logistic回归分析结果显示,rs1801133位点的TT基因型、T等位基因,rs1801131位点的AC基因型、AC+CC基因型、C等位基因与叶酸治疗HHcy疗效有回归关系(P<0.05)。MDR软件结果显示,最优模型为高血压病史、冠心病病史和rs1801133的三因素交互模型(P<0.05)。结论 MTHFR rs1801133位点的TT基因型和等位基因T可增加叶酸治疗HHcy失败的风险;rs1801131位点的AC基因型、AC+CC基因型和等位基因C可降低叶酸治疗HHcy失败的风险。MTR rs1805087位点基因型及等位基因与叶酸治疗HHcy疗效无回归关系。高血压病史、冠心病病史、rs1801133位点对叶酸治疗HHcy的疗效具有交互作用。

亚甲基四氢叶酸还原酶及甲硫氨酸合成酶基因多态性与男性不育

易感基因、环境及营养等因素在疾病发生过程中起到了重要作用。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶(MS)是叶酸和同型半胱氨酸(Hcy)代谢中的重要酶,其活性缺陷可能引起体内高同型半胱氨酸血症和DNA甲基化异常而导致多种疾病。目前对MTHFR基因单核苷酸多态性C677T与男性不育的相关性报道结论不一,而对另两种单核苷酸多态性(MTHFR A1298C、MS A2756G)与男性不育的相关性报道鲜见。就MTHFR及MS基因多态性与男性不育的研究进展作一综述。

甲硫氨酸合成酶基因A2756G多态性与2型糖尿病合并脑梗死的相关性

目的研究甲硫氨酸合成酶(MS)基因A2756G多态性与2型糖尿病合并脑梗死的相关性。方法采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法鉴定安徽地区562例汉族人MS基因A2756G多态性基因型,比较对照组、2型糖尿病组、2型糖尿病合并脑梗死组各组间不同基因型及等位基因频率。结果安徽地区汉族人群存在MS基因A2756G多态性,其G等位基因频率与西方人群比较明显降低,2型糖尿病合并脑梗死组的MS不同基因型及等位基因频率与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论MS基因A2756G多态性与安徽地区汉族人群2型糖尿病合并脑梗死的遗传易感性无关。

重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶的表达纯化和鉴定

目的对重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(recombinant human betaine-homocysteine S-methyltrans-ferase,rhBHMT)进行表达纯化和鉴定。方法采用基因重组技术在原核系统表达BHMT蛋白,镍螯合亲和层析和Sephacryl S200层析进行纯化。产物经SDS-PAGE、HPLC、N端氨基酸序列检测与活性验证。结果终产物rhBHMT纯度达97.9%。相对分子质量为45 000,N端氨基酸序列与理论序列一致。结论从工程菌中获得具有活性的高纯度rhBHMT,产物均一,工艺稳定,为中试放大提供可靠依据。

植物中SAM Mtases基因研究进展

SAM Mtases是从多种植物中分离到的一类S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性氧位甲基转移酶基因,该基因对植物体内木质素、类苯基丙烷、类黄酮类、生物碱和脂肪族化合物等许多次生代谢产物合成有直接的影响,并且在植物抗病、抗紫外线、杀虫、抗菌、植物激素生长和信号调节、植物共生、花粉管伸长和花粉生长等生理过程中起重要作用.该文总结了国内外已经克隆到的SAM Mtases同源基因的分离、分类及其功能,为进一步研究SAM Mtases基因在植物生理代谢调控中的地位及在植物抗性及药用成分育种上的应用提供参考.

华中地区神经管缺陷家庭叶酸代谢相关基因的单核苷酸多态性研究

目的通过对叶酸代谢相关基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与环境危险因子交互作用的关联分析，寻找神经管缺陷（neural tube defects，NTD）致病基因及环境危险因素。方法收集NTD流产胎儿组织标本或患儿血标本（n＝278）及其正常双亲的血标本（n＝478），记录母亲围孕期补充叶酸、糖尿病、服药史等情况。采用CEQ8800系统进行多重SNP分析，对所有样本叶酸代谢相关的12个基因共28个SNP测序。通过病例-双亲对照研究及传递／不平衡检验，分析SNP与环境危险因子（孕期补充叶酸、母亲糖尿病、孕期服药史）的交互作用对NTD发病的影响。结果亚甲基四氢叶酸还原酶（基因为MTHFR）rsl801133与NTD的关联具有统计学意义，而且环境风险因子（未补充叶酸、母亲糖尿病）对NTD的发生起增效作用；而甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶（基因为BHMT）rs3733890仅在未补充叶酸层与NTD存在连锁不平衡，基因型本身并不能单独导致疾病；而其他基因的SNP与NTD的发生没有显著关联。结论MTHFRrsl801133是NTD的危险因子，而BHMTrs3733890不是NTD的独立危险因子。未来尚需要对更大的样本进行基因与基因、基因与环境交互作用的研究以探讨NTD的发病原因。

孕妇叶酸代谢相关基因与胎儿先天缺陷的相关性研究

目的分析叶酸代谢相关基因的多态性与胎儿先天缺陷的相互关系，探讨遗传性因素对胎儿先天缺陷的影响。方法 回顾性分析132例不良妊娠孕妇（病例组）及同期就诊的150例正常妊娠孕妇（对照组）5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因的C677T、A1298C位点和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因A66G位点的基因型和基因频率，及其血清叶酸、维生素B12（Vit B12）和同型半胱胺氨酸（HCY）水平之间的差异。结果 病例组的血清叶酸与Vit B12呈正相关，与HCY呈负相关，仅有胎儿骨骼系统缺陷孕妇（6例）的HCY高于对照组（t＝3.409，P〈0.05）。病例组MTHFR基因C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点的基因型频率与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；以上三个基因位点的C/T、A/C、A/G基因频率与对照组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。病例组和对照组MTHFR基因A1298C位点与C667T位点的不同基因型组合差异无统计学意义（P〉0.05），未见有协同作用。结论 孕妇的叶酸代谢相关MTHFR和MTRR基因的多态性对母体相应的代谢产物水平变化有一定影响，但其与胎儿先天缺陷发生的遗传学机制的相关性有待更多的大样本研究结果深入探讨。

高半胱氨酸与眼缺血综合征相关性的研究进展

高半胱氨酸（Hcy）是一种含巯基的氨基酸,主要来源于饮食中摄取的蛋氨酸（甲硫氨酸）,是蛋氨酸与半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物.Hcy可引起内皮细胞机能障碍与损伤,并加速凝血酶的形成,促进血管平滑肌增生,从而造成血管损伤并导致静脉血栓形成等改变.Hcy作为慢性缺血性脑卒中及心血管疾病的预测因子,其水平的增高与颈动脉阻力增高、颈动脉狭窄或闭塞、大血管粥样硬化相关,与眼缺血综合征（OIS）的发生发展存在相关性,可协助诊断颈动脉狭窄情况下的OIS.OIS患者血浆Hcy水平、高Hcy血症发病率均高于视网膜静脉阻塞、颈内动脉狭窄患者.降低患者的血浆Hcy浓度能否防治OIS及其心脑血管疾病等并发症的问题还需进一步证实.