一种高R-选择性水解R,S-甲霜灵的酯酶基因的克隆表达及表征

【目的】将一种可以高选择性水解R-甲霜灵的新脂酶基因,在大肠杆菌中进行克隆和表达,并研究重组脂酶的性质。【方法】根据已知的目标酯酶N端10个氨基酸序列,在已测序的Albibacters sp.zjut528基因组中找到相匹配的一个酯酶基因,它全长969 bp,编码322个氨基酸,将该基因命名为RMest。通过引物扩增得到该基因的DNA片段,将它与表达载体pET-28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold(DE3),构建重组菌,IPTG诱导表达该酯酶,并用Ni2+亲和层析介质进行纯化。【结果】在重组菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21 Gold(DE3)中成功表达了重组酯酶RMesterase,大小约为46 kDa。用胞内重组酶液催化水解R,S-甲霜灵,底物浓度10 g/L,反应6 h,底物转化率为49.8%,产物(甲霜灵酸)的eep为99.3%,对底物的对映体R-构型具有专一(选择)性。该酶最适温度和pH分别为40℃和pH 9.0。该酶的活性受到产物甲醇的抑制。通过Blast+在Uniprot KB数据库中搜寻与酯酶RMest同源的蛋白,采用邻近法构建该酶的蛋白系统发育树,结果显示它与某些Lysophospholipase、AB hydrolase-1 domain-containing protein和Esterase的同源性最高,但是与它们均存在较大的进化距离,表明该酶是一种相对独立进化的新酯酶。【结论】在大肠杆菌中成功克隆和表达了一种新的脂酶基因RMest,重组酯酶RMesterase可以高手性选择性水解R,S-甲霜灵生成R-甲霜灵酸。

生物法拆分外消旋甲霜灵制备R-甲霜灵

从土壤和污泥样品中分离得到一株能不对称水解甲霜灵的革兰阴性菌。通过分子生物学鉴定,命名该菌株为Albibacters sp.zjut528。当底物浓度为50 g·L^(-1),湿菌体(含水量81%):底物=0.3:1(质量比),反应28 h,产物得率为47.1%,主产物为R-甲霜灵酸,对映体过量值eep>99.9%。将菌株细胞破碎得到的粗酶液分离纯化得到一个SDS-PAGE电泳纯的酯酶,分子量约为40×10~3,酶的N端10个氨基酸序列为NH2-Ala-Ala-Lys-Ala-Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu。该酶最适温度为40℃,20~40℃稳定性较好。最适pH为9.0,在pH 5.0~10.0范围内稳定。Fe^(2+)、Mn^(2+)、Zn^(2+)对酶活有促进作用,Fe^(3+)对酶活有一定的抑制作用。在含有20%的乙腈、异丙醇、丙酮、二异丙醚、环己烷、正己烷的水溶液中,酶活均比在纯水相中有明显提高。该酶反应动力学符合米氏方程,Vm为0.18 mmol·L^(-1)·min-1,Km为2.29 mmol·L^(-1),Kcat为0.85 min^(-1)。建立了一条利用Albibacters sp.zjut528细胞作催化剂拆分甲霜灵制备R-甲霜灵的工艺路线,终产品R-甲霜灵的纯度是96.2%,ee值为99.3%。