Sirt1对糖尿病心肌病大鼠早期心肌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的调节作用及其机制研究

目的:通过建立糖尿病大鼠模型,探讨沉默信息调节因子(Sirt1)对S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)糖尿病心肌病早期的调节作用及其机制。方法:采用高脂饮食联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,分为对照组、早期糖尿病模型组(DM组)和白藜芦醇处理组(RES组),RES组给予白藜芦醇2.5 mg/(kg·d)灌胃2周处理。HE染色法观察心肌组织病理结构变化,超声心动图检测心功能相关指标,高效液相色谱法检测同型半胱氨酸(Hcy)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)及S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),Western blot检测各组心肌组织SAHH、Srit1等蛋白表达变化。结果:显微镜下DM组大鼠心肌组织可见不同程度炎细胞浸润、甚至变性,而RES组心肌组织可见少量炎性细胞浸润,少量心肌细胞呈长杆状,坏死灶不明显,嗜酸性变较DM组轻。HPLC检测结果显示对照组、DM组和RES组的Hcy分别为(45.37±7.99)、(101.78±16.77)和(86.33±10.09)μmol/L,DM组和RES组较对照组升高,但RES组低于DM组;SAH分别为(50.33±7.34)、(22.92±4.32)和(33.45±7.88)μmol/L,DM组和RES组较对照组降低,但RES组高于DM组;SAM分别为(66.34±9.99)、(69.56±9.01)和(70.89±11.33)μmol/L,各组间无显著差异;SAHH分别为(44.11±5.17)、(92.33±17.56)和(19.73±4.07)μmol/L,DM组较对照组升高,RES组较对照组降低;Srit1分别为(80.12±10.09)、(29.11±3.91)和(107.32±13.24)μmol/L,DM组较对照组降低,RES组较对照组升高。结论:SAHH及下游Hcy等的表达可能是早期糖尿病心肌病发生发展的重要作用机制,而Sirt1对SAHH的表达调控作用可能起重要作用。

S-腺苷同型半胱氨酸升高与人脐静脉内皮细胞损伤及整体基因组甲基化的关系分析

目的:探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)升高对血管内皮细胞的损伤效应与整体基因组甲基化的关系。方法:以永生化的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)为研究对象,用不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)抑制剂3-deazaadenosine(DZA)处理24、48、72h,使用光学显微镜观察细胞形态学变化,电子显微镜观察细胞器超微结构变化,反相高效液相色谱法(reversed phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定胞内SAH浓度,荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)测定Hcy的浓度,MTT法检测细胞生长增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,胞嘧啶延伸法检测整体基因组DNA甲基化水平。结果:HUVEC经DZA处理后,形态学上出现凋亡或坏死特征,培养基中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)浓度下降,胞内SAH含量升高,细胞的生长增殖能力降低并出现凋亡现象,整体基因组的甲基化水平降低。结论:SAH升高能导致血管内皮细胞的损伤,且这种作用与整体基因组甲基化水平有关,SAH可能是动脉粥样硬化形成过程中的潜在生物标志分子。

慢性肾脏病患者血清S-腺苷同型半胱氨酸与心血管并发症的关系

目的研究同型半胱氨酸(Hcy)的前体物质———腺苷同型半胱氨酸(SAH)水平与慢性肾脏病(CKD)患者心血管并发症的关系。方法选择CKD患者55例和对照组32例,检测并记录患者心血管并发症,酶连续循环比色法检测血清SAH浓度,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清Hcy浓度,同时采用全自动免疫分析仪检测血清叶酸、维生素B12浓度。结果 CKD患者血清Hcy及SAH均较对照组明显升高,且SAH升高程度更明显。有心血管并发症者血清SAH水平明显高于无并发症组。多因素逐步logistic回归分析显示,高SAH血症是CKD患者心血管并发症的危险因素。两组血清叶酸和维生素B12水平无明显差异。结论 CKD患者血清SAH水平较Hcy更敏感预测心血管并发症,血清SAH与Hcy水平均与患者的肌酐水平明显相关。

以S-腺苷同型半胱氨酸水解酶为潜在靶点的新药研究进展

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)是细胞内广泛存在的一种酶,它催化S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)水解生成腺苷和同型半胱氨酸。抑制SAHH将导致细胞内甲基化抑制物AdoHcy的堆积,从而对转甲基反应产生反馈性抑制作用。而甲基化对于维持细胞的活性是必需的。鉴于SAHH在调节生物体转甲基化反应中的核心地位,它已被选择作为多种新药研发的重要靶点,包括免疫抑制剂、抗病毒药、防治动脉粥样硬化和阿尔茨海默病药物。SAHH抑制剂全新的化学结构、良好的作用效果和独特的作用靶点已引起国内外研究者广泛的兴趣。

慢性肾脏病患者血浆S-腺苷同型半胱氨酸水平与基因组DNA甲基化的关系

目的研究慢性肾脏病(CKD)患者血浆S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水平与整体基因组DNA甲基化的关系。方法选择CKD患者43例和健康对照组36例,ELISA法检测血清Hcy浓度,酶连续循环比色法检测血清SAH浓度,高效液相色谱检测基因组DNA甲基化程度。结果 CKD患者血浆SAH较健康对照组明显升高,而基因组DNA甲基化水平降低。血浆SAH浓度与基因组DNA甲基化呈明显负相关。结论 CKD患者血浆SAH水平升高可导致异常的基因组DNA甲基化,可能参与CKD患者心血管并发症的发生发展。

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖中作用机制的研究

目的探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl hom ocysteine;SAH)水解酶(SAH H)在同型半胱氨酸(H om ocysteine;H cy)致平滑肌细胞增殖中的作用机制。方法原代培养平滑肌细胞(VSM C s),用0、50、100、200、500μM浓度H cy干预VSM C s,高效液相色谱法(H PLC)检测S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylm ethionine,SAM)和SAH含量的变化;实时R T-PC R和W estern blot检测SAH H表达的变化;M TT法检测H cy对VSM C s增殖的影响。结果 H PLC结果表明,VSM C s与0、50、100、200、500μM H cy培养72 h后,细胞中SAH的含量明显增加,而细胞中SAM的含量和SAM/SAH的比值下降,与对照组比较,差异均有显著性(P<0.05),实时R T-PC R和W estern blot结果显示,SAH H m R N A和蛋白水平下降,与对照组比较差异有显著性(P<0.05),M TT显示,在50μM H cy组,VSM C s数量明显增加,而100、200、500μM H cy组VSM C s数量反较对照组减少。结论 SAH H表达下调致使SAM/SAH的比值下降可能是H cy引起VSM C s增殖的重要机制之一。

高效液相色谱紫外检测法同时测定小鼠红细胞中S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸

建立了高效液相色谱紫外检测同时测定红细胞中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的方法。采用ZORBA×Eclipse×DB-C8色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以含3 mmol/L庚烷磺酸钠的40 mmol/L磷酸钠缓冲溶液(pH 3.72)-甲醇(95∶5,V/V)为流动相,流速0.9 mL/min,柱温35℃,紫外检测波长设置:0～8.00 min,450 nm;8.01～16.00 min,260 nm。SAH与SAM的线性范围分别为0.25～3.0 mg/L和0.50～10 mg/L,检出限分别为0.15和0.07 mg/L。方法日内和日间相对标准偏差(RSD)分别小于6.5%和7.4%,平均回收率为80.9%～116.2%。利用本方法对19例叶酸缺乏孕小鼠和11例健康对照孕小鼠红细胞进行测定。结果表明:叶酸缺乏组SAH明显高于健康对照组,而SAM两组间无显著差异。

S-腺苷同型半胱氨酸对大鼠主动脉内皮细胞增殖及凋亡的影响

目的研究S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)对大鼠主动脉内皮细胞增殖和凋亡的影响,以及对细胞培养上清液中VCAM-1含量的影响。方法将不同浓度的AdoHcy水解酶抑制剂3-deazaadenosine(DZA)作用于鼠主动脉内皮细胞(SVAREC)24、48和72 h后,荧光偏振免疫分析法测定同型半胱氨酸(Hcy)浓度,反相高效液相色谱法测定AdoHcy浓度,WST-1法检测细胞增殖,TUNEL法检测细胞凋亡,ELISA法检测细胞培养上清液VCAM-1含量。结果SVAREC经不同浓度DZA处理后,Hcy浓度降低而细胞内AdoHcy浓度上升,细胞增殖能力下降并出现凋亡,细胞培养上清液中VCAM-1含量升高。结论AdoHcy可抑制SVAREC增殖,促进其凋亡及诱导炎性因子VCAM-1的表达,从而致主动脉内皮细胞损伤,参与动脉粥样硬化的形成。

南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因的克隆及其生物信息学分析

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,SAHH)是一种细胞内广泛存在的酶,在调节生物体转甲基化反应中占据重要地位。本研究通过RT-PCR及RACE-PCR技术克隆了南极冰藻(Chlamydomonas sp.ICE-L)S-腺苷同型半胱氨酸水解酶全序列,命名为ICE-LSAHH。ICE-LSAHH全长1 844 bp,包括5′非编码区36 bp,3′非编码区344 bp,含有一个较长的poly(A)尾。开放阅读框1 461 bp,编码487个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其分子量为53.0 kD,理论等电点为5.16。SignalP 3.0、TMHMM Server v.2.0、NetNGlyc 1.0和NetPhos 2.0预测结果显示,ICE-LSAHH蛋白不存在信号肽与跨膜区,含有1个N-糖基化位点及23个磷酸化位点。利用ClastalX 2.0及MEGA 5.0软件,以邻位相连法对南极冰藻及其他物种SAHH构建系统进化树,结果显示,ICE-LSAHH与杜氏盐藻(Dunaliella salina)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小球藻(Chlorella variabilis)等有较近亲缘关系。利用SWISS-MODEL程序和PyMOL Viewer软件成功模拟了ICE-LSAHH蛋白亚基的三维结构,该结构包括20个α-螺旋和12个β-折叠,且存在3个结构域:N端底物结合域、NAD结合域和C端域。可见,SAHH基因存在于南极冰藻并进行了有效的表达,该蛋白定位于细胞质,进一步证实SAHH是一个进化上比较保守的蛋白。

南极嗜冷假单胞菌7197S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)基因的克隆与序列分析

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株耐冷菌株7197,其16S rDNA序列分析表明该菌株属于假单胞菌属(Pseu-domonas)。作者通过设计引物,从该菌的全基因组DNA中克隆到编码S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAHH)的完整ORF,全长为1424bp。使用DNAMAN(5.1)软件对全长ORF为1424bp的SAHH基因进行分析,SAHH基因编码一个由474AA残基组成、分子量预计为52523 Da的SAHH蛋白质,与Psychrobacter sp.273-4的SAHH有96.84%的相似性;与Acinetobacter sp.ADP1的SAHH有79%的相似性;与Pseudomonas fluorescens Pf-5的SAHH有75%的相似性。

胞内S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和ER-α表达的关系

目的探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)升高抑制血管内皮细胞增殖和雌激素受体-α(estrogen receptor-α,ER-α)基因表达变化的关系。方法以分离的原代人脐静脉内皮细胞(hu-man umbilical vein endothelial cell,HUVEC)为研究对象,经不同浓度的SAH水解酶强效抑制剂3-deazaadenosine(DZA)处理24～72h后,反相高效液相色谱法测定胞内SAH浓度,利用细胞计数法、流式细胞仪和TUNEL技术检测细胞的增殖凋亡能力,Western blot法检测ER-α蛋白的表达,荧光定量-PCR检测其mRNA表达,甲基化特异PCR法检测ER-α基因启动子甲基化状态。结果经DZA处理后,HUVEC胞内SAH浓度升高(P<0.05),生长增殖能力降低(主要受阻于G1/G0期),凋亡率增加(P<0.05),ER-α mRNA和蛋白的相对表达量降低(P<0.05),但DZA处理前后ER-α基因启动子甲基化状态不发生明显改变。结论SAH升高抑制HUVEC的增殖能力与ER-α的表达变化有关,但这种作用不是通过改变ER-α基因启动子的甲基化而实现的。

S-腺苷同型半胱氨酸与动脉粥样硬化

同型半胱氨酸(Hcy)一直被视为心血管疾病的一个独立危险因素,但近年来的研究发现高Hcy很可能不是引起血管损伤的真正致病因素,而只是一个伴随现象。Hcy的前体物质S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)可由Hcy逆向合成,SAH升高能诱导血管内皮细胞的损伤,参与动脉粥样硬化的形成,其机制与抑制DNA甲基化有关。SAH可能是较Hcy更敏感的预测心血管疾病风险的指标。

HPLC法测定人红细胞中的S-腺苷同型半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸

目的建立HPLC法测定人红细胞中S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）浓度的方法。方法人红细胞经同体积醋酸盐缓冲液稀释后,经10%高氯酸蛋白沉淀后直接进样。采用Athena C18 WP柱（150 mm×4.6 mm,3μm）,柱温35℃,流动相为含5 mmol·L-1庚烷磺酸钠的50 mmol·L-1 Na H2PO4缓冲液（pH 4.0）-甲醇（80：20,v/v）,流速：1.0 m L·min-1,检测波长254 nm。采用外标法定量。结果SAH和SAM分别在0.025-10 mg·L-1和0.05-20 mg·L-1内线性关系良好,SAH和SAM的日内、日间RSD均〈12%,加样回收率在95.5%-106.3%,样品提取后在24 h内稳定性良好。结论该法快速、简便、准确,适用于SAH和SAM的体内分析检测。

非马沙坦对2型糖尿病大鼠早期心肌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的调节作用

目的:探讨非马沙坦(FIM)在糖尿病心肌病(DCM)早期发生发展过程中的干预作用及对S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的调节作用。方法:健康雄性SD大鼠,高脂饮食5周后,腹腔注射链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,实验将大鼠分为正常对照(control)组、早期糖尿病模型(DM)组和DM+FIM组,DM+FIM组在造模成功后给予FIM灌胃处理。4周后,对各组动物进行血清学检测,包括空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和空腹胰岛素(FINS)的水平,超声心动图检测心功能相关指标,高效液相色谱法(HPLC)检测同型半胱氨酸(Hcy)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)及S-腺苷半胱氨酸(SAH)的含量,Western blot检测各组大鼠心肌组织中SAHH等蛋白表达变化。结果:2型糖尿病大鼠模型造模成功率为84%,与DM组相比,DM+FIM组动物体重增加显著(P<0.05),心脏指数、左心室指数、FBG和LDL-C明显降低(P<0.05);超声心动图检测显示,与DM组相比,DM+FIM组大鼠射血分数明显升高(P<0.05);HPLC检测结果显示,Hcy水平和SAM/SAH显著降低(P<0.05);Western blot检测结果显示,相对于control组,DM组心肌组织中SAHH的表达显著升高,而DM+FIM处理组则下降。结论:SAHH及下游Hcy等因子的表达可能是早期糖尿病心肌病发生发展的重要作用机制,而非马沙坦可能通过抑制SAHH表达而减轻DCM。

束缚应激对大鼠S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸代谢的影响

目的探讨束缚应激对肝脏S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）代谢的影响。方法Wistar大鼠16只随机均分为对照组和束缚应激组，束缚组每天束缚6h，束缚6周。然后处死大鼠，用高效液相色谱法测定肝组织中SAM、SAH和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的活性。以SAH单位时间生成量和减少量来计算该酶的合成活性和水解活性。结果束缚组大鼠肝脏SAM含量显著低于对照组（P〈0．05），而SAH含量却显著高于对照组（P〈0．05），束缚组SAM／SAH显著低于对照组（P〈0．05），两组SAHH合成活性间差异无统计学意义（P〉0．05），但束缚组SAHH水解活性显著低于对照组（P〈0．05）。结论慢性束缚应激可能抑制机体转甲基作用。

高效液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠肝脏中S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸

建立了同时检测大鼠肝脏中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的高效液相色谱-串联质谱法。肝脏样品匀浆后用5.0 mmol/L NH4Ac+0.4%HAc+2%甲醇提取,采用CORTES UPLC-C18+柱分离,在电喷雾电离正离子模式(ESI+)下,以多反应监测(MRM)检测,外标法定量。SAM在0.1~2.0μg/mL范围内线性关系良好(R2=0.997);SAH在0.01~0.20μg/mL范围内线性关系良好(R2=0.999);SAM和SAH的方法定量限(S/N>10)分别为0.250、0.025μg/g;幼年SD大鼠肝脏中SAM和SAH的含量分别为86.34±5.54μg/g、17.73±2.24μg/g;相对标准偏差分别是6.4%和11.5%。该方法灵敏度高、特异性强,适用于大鼠肝脏组织中SAM和SAH的同时测定。

血浆S-腺苷同型半胱氨酸水平检测与冠状动脉狭窄程度的关系研究

目的探讨血浆中S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosine homocysteine,SAH)与冠状动脉狭窄程度的关系。方法选取2018年1月~2019年12月于简阳市人民医院就诊的疑似冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CHD)患者663例作为研究对象,根据冠状动脉造影检查结果,将患者分为CHD组(经冠状动脉造影确诊)(n=386)和对照组(n=277)。采集空腹静脉血标本检测血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、脂蛋白(a)[Lipoprotein a,LP(a)]、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)和SAH水平,采用Gensini积分法评估CHD组冠状动脉狭窄程度,并分析上述指标与其相关性。结果CHD组患者LDL-C,LP(a),Hcy和SAH水平高于对照组,而HDL-C水平低于对照组,差异均具有统计学意义(t=3.71~14.70,均P<0.05);CHD组患者冠状动脉狭窄程度Genisini积分与患者LDL-C,LP(a),Hcy和SAH呈正相关(r=0.408~0.635,均P<0.05),而与HDL-C呈负相关(r=-0.404,P<0.05)。结论CHD患者血浆SAH水平明显升高,与传统血清学指标相比,血浆SAH浓度水平与冠状动脉病变程度的相关性最高,血浆SAH可能是一种新的生物学标志物用于CHD的临床诊断,在临床诊疗过程中可将血浆SAH用于评估冠脉病变情况,对于CHD的预防和诊疗具有重要意义。

S-腺苷同型半胱氨酸与冠心病相关性的研究进展

近年来,同型半胱氨酸(Hcy)的前体物质S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)作为一种新的生物标志物与动脉粥样硬化(AS)有着密切关系,而SAH作为一种新的冠心病(CAD)标志物也越来越受到广泛关注。血浆SAH升高可通过改变DNA甲基化状态,进而导致动脉粥样硬化的形成。血浆SAH可能是比Hcy更好的血管疾病指标。

高效液相色谱法同时测定血浆中S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸

目的建立同时测定血浆中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的高效液相色谱分析方法,并对正常人血浆中的含量进行测定。方法样品用400g/L三氯乙酸处理,离心取上清液过膜,以50mmol/L NaH2PO4缓冲液(pH4.38)、庚烷磺酸钠和甲醇为流动相,选用Venusil MP-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱进行色谱分离,流速为1.0ml/min,柱温30℃,紫外检测波长254nm。结果 SAM和SAH在相应检测浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系(r>0.9999);方法回收率在94.14%～102.44%,相对标准偏差在1.00%～8.10%。正常人血浆中SAM和SAH的含量分别为0.032～0.080mg/L和0.004～0.010mg/L。结论该方法用于血浆中SAM和SAH的检测简便快速,准确可靠。

抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶活性促进大鼠主动脉血管平滑肌细胞衰老

目的探究抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)活性,升高S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水平,对大鼠主动脉血管平滑肌细胞(RAVSMCs)衰老的影响。方法培养RAVSMCs细胞,随机分为Scrambled组、SAHH siRNA组、Control组、腺苷二醛(ADA)组,Scrambled组转染对照RNA(5 nmol/L),SAHH siRNA组转染SAHH siRNA(5 nmol/L),Control组在平滑肌细胞培养基内加入二甲基亚砜(DMSO),ADA组在平滑肌细胞培养基内加入SAHH抑制剂ADA(30μmol/L),干预时间24 h。采用质谱检测RAVSMCs内SAH水平,之后进行相关衰老指标的检测,使用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色方法检测细胞衰老的情况;通过Western blot检测细胞中p16和p21的蛋白表达水平;采用EdU-488方法检测细胞的增殖能力。结果与Scrambled组比较,SAHH siRNA组SAH水平、SA-β-gal阳性率、p16蛋白、p21蛋白表达水平显著升高,细胞增殖能力显著下降,差异均有统计学意义(t=7.604、16.750、2.906、5.735、4.236,P均<0.05);与Control组比较,ADA组SAH水平、SA-β-gal阳性率、p16蛋白、p21蛋白表达水平显著升高,细胞增殖能力显著下降,差异均有统计学意义(t=27.910、34.080、3.359、4.769、16.670,P均<0.05)。结论抑制SAHH活性,升高SAH水平会诱导RAVSMCs衰老。