不同来源S-腺苷甲硫氨酸合酶在大肠杆菌中的表达及催化应用

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是一种重要的代谢中间体,对机体代谢活动的正常运行起重要作用,它是由底物L-甲硫氨酸和ATP在SAM合酶催化下生成的,目前主要应用于医药行业。该研究首先以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum基因组为模板扩增出SAM合酶编码基因BcmetK和CgmetK,以pETDueT1质粒为载体,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为底盘细胞,构建了SAM合成菌株E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK和E.coli BL21/pETDuet1-CgmetK。其次,针对SAM合成菌株全细胞催化合成体系条件进行了优化,重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度50 mmol/L、1.2%(体积分数)的OD_(600)值约9.0的细胞悬浮液、600 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO_(4)、100 mmol/L K_(2)SO_(4)、45℃、pH 8.0]下,连续转化5 h,获得了464 mg/L的SAM。重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-CgmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度40 mmol/L、0.8%(体积分数)的OD_(600)值约9.0的细胞悬浮液、800 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO 4、100 mmol/L K_(2)SO 4、45℃、pH 8.5]下,连续转化5 h,获得了528 mg/L的SAM,可见,谷氨酸棒杆菌来源的SAM合酶催化能力优于蜡状芽孢杆菌来源的,更有利于SAM的合成。该研究成功构建了SAM合成菌株,虽然产量水平不高,但为SAM的可持续生物合成提供了重要借鉴。

S-腺苷甲硫氨酸的细胞生物化学功能及其开发应用研究

综述了生物体内一种重要的代谢中间体S-腺苷甲硫氨酸的生物学功能,并介绍了其生产制备和临床应用的进展。

S-腺苷甲硫氨酸联合还原型谷胱甘肽治疗妊娠期肝内胆汁淤积症

目的:探讨S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)联合还原型谷胱甘肽治疗妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)的临床效果。方法:选取本院2012年1月-2015年6月收治的117例ICP患者采用SPSS 16.0软件生成随机数字表后分为联合组58例和对照组59例,2组患者均采用SAM+常规治疗,联合组加用还原型谷胱甘肽治疗,2组患者的疗程均为4周,对比2组的治疗效果。结果:治疗前联合组和对照组的血总胆汁酸(TBA)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平及瘙痒程度评分差异无统计学意义(P>0.05);治疗后2组患者的血TBA、ALT、AST水平及瘙痒程度评分均较本组治疗前显著降低(P<0.05);治疗后,联合组患者的血TBA、ALT、AST水平及瘙痒程度评分低于对照组患者,差异有统计学意义(P<0.05);2组分娩孕周、胎儿窘迫、Apgar评分及新生儿体质量比较,差异无统计学意义(均P>0.05);联合组剖宫产率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:还原型谷胱甘肽联合SAM治疗ICP较单用SAM具有更加显著的临床效果。

S-腺苷甲硫氨酸的研究现状及应用前景

介绍了S-腺苷甲硫氨酸的制备方法及稳定性研究现状,并对其临床应用及市场前景进行了分析。

S-腺苷甲硫氨酸联合还原型谷胱甘肽治疗妊娠期肝内胆汁淤积症效果分析

目的:研究S-腺苷甲硫氨酸联合还原型谷胱甘肽应用在妊娠期肝内胆汁淤积症的临床疗效。方法:选取笔者所在医院2015年1月-2016年12月收治的72例妊娠期肝内胆汁淤积症患者作为本次研究对象,按照随机数字表法将其分为研究组和对照组,每组36例,两组患者均应用S-腺苷甲硫氨酸常规治疗,研究组在此基础上加用还原型谷胱甘肽治疗,对比分析两组患者的治疗效果,谷丙转氨酶与血总胆汁酸及谷酸转氨酶水平,并比较两组的各项评分。结果:研究组剖宫产率(30.55%)显著低于对照组(63.89%),组间比较差异有统计学意义(P<0.05);两组在分娩孕周、Apgar评分与新生儿体质量和胎儿窘迫方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。研究组治疗后的瘙痒程度评分为(0.42±0.16)分,对照组瘙痒评分为(0.76±0.19)分,组间比较差异有统计学意义(t=8.212 7,P<0.05)。研究组的血TBA、ALT与AST水平显著低于对照组,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:S-腺苷甲硫氨酸联合还原型谷胱甘肽应用在妊娠期肝内胆汁淤积症的效果显著,能够有效提高患者的治疗总有效率,值得临床应用探索。

S-腺苷甲硫氨酸治疗复发性流产早期妊娠肝酶异常临床分析

本文通过回顾分析早期妊娠保胎治疗期间合并肝酶异常患者,探讨应用S-腺苷甲硫氨酸治疗早期妊娠肝酶异常患者的有效性和安全性。结论认为S-腺苷甲硫氨酸在早期妊娠期间用于治疗肝酶异常效果显著,但安全性尚需进一步研究。

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖的3-氨基-3-羧基丙基利用酶研究进展

S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是生物体内重要的辅因子。SAM的结构中具有3个不稳定的C-S键,不同的SAM依赖酶能够选择性地切割其中不同的C-S键来催化各种类型的反应。其中,利用SAM甲基部分的甲基转移酶和腺苷部分的SAM自由基酶被广泛研究。UniProt数据库中保存了超过1800000条SAM依赖的甲基转移酶序列;SAM自由基酶也已经成为最大的酶家族之一,数目超过700000个。但利用SAM中3-氨基-3羧基丙基(3-amino-3-carboxypropyl,ACP)的酶却报道相对较少,本文对目前这一类酶的研究进行分类介绍,并对这一领域未来研究方向进行展望。

S-腺苷蛋氨酸治疗肝脏疾病的现有证据及临床应用价值

无论何种病因，肝脏疾病的进展都受到宿主遗传因素、病原体和其他环境因素间相互作用的影响［1］。营养状态也是其中之一，必需氨基酸蛋氨酸及其活性代谢物 S-腺苷蛋氨酸（SAMe）与肝病进展也相关［2］。有证据表明慢性肝病中会出现SAMe 耗竭，SAMe 也曾被用于治疗某些疾病状态［3］。由于前期研究取得了一些鼓舞人心的结果但缺乏有效替代药物，在东欧、俄罗斯、中国、南亚和南美等国家和地区广泛采用 SAMe 治疗慢性肝病和肝内胆汁淤积。因此，有必要对 SAMe 在慢性肝病发病机制中的作用进行讨论，并认真回顾补充 SAMe 临床价值的证据。

腺苷蛋氨酸在妊娠期肝内胆汁淤积症治疗中的应用

目的:探讨腺苷蛋氨酸对妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)患者皮肤瘙痒的治疗价值及对妊娠结局的影响。方法:ICP患者68例,随机分为治疗组和对照组各34例;对照组应用常规治疗,包括:卧床休息、吸氧、熊去氧胆酸、地塞米松的应用等。治疗组在常规治疗的基础上,应用腺苷蛋氨酸1g/d静脉点滴治疗。结果:治疗组瘙痒评分由3.7±0.3降至1.2±0.6分,对照组瘙痒评分由3.6±0.8降至2.4±0.6分,两组比较差异有非常显著性(P<0.01)。治疗组平均孕周37.2±0.9周,对照组平均孕周34.1±1.1周,两组比较差异有显著性(P<0.05);治疗组剖宫产23例(占63.89%),对照组剖宫产26例(占72.22%),两组比较差异无显著性(P>0.05)。治疗组胎儿宫内窘迫、新生儿窒息、新生儿颅内出血、生产后出血的发生率均低于对照组。结论:腺苷蛋氨酸可改善ICP患者的皮肤瘙痒症状及围产儿结局,是治疗ICP的有效药物。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶及其在S-腺苷甲硫氨酸合成中的应用

S 腺苷甲硫氨酸 (SAM)参与多种生化反应 ,是生物体内重要的中间代谢物。其制备方法有化学合成法、发酵法和酶促转化法 3种。酶促转化法主要涉及S 腺苷甲硫氨酸合成酶 ,文章着重介绍了大肠杆菌、酵母和大鼠肝脏的SAM合成酶及其编码基因和SAM合成酶基因工程菌酶法转化生产SAM的研究。

S-腺苷甲硫氨酸研究进展

综述一种重要代谢中间物质 S-腺苷甲硫氨酸的体内代谢功能、制备、稳定化研究和临床应用进展。

烟草中一条新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用差异显示技术从烟草中分离到一个受乙烯利诱导表达的cDNA片段,结合RACE扩增技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1350个碱基,编码区有1170bp,通过GenBank同源性比较发现它与一条已知的烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS1,EC2.5.1.6)的基因编码区存在90%的同源性,编码的氨基酸顺序96%同源,而在cDNA的5'及3'非编码区同源性很低,且有一些短片段的缺失。设计合适的引物分别对这两个SAMS基因进行RT-PCR分析表明,SAMS1基因受高温诱导表达增强,但不受甲基紫晶诱导的氧化胁迫及盐胁迫影响,而新分离到的这个基因(SAMS2)的表达同时受高温、甲基紫晶及高盐3种胁迫的诱导。

S-腺苷甲硫氨酸代谢途径相关基因在小麦水分胁迫中的表达

以小麦品种‘晋麦47’为材料,利用半定量RT-PCR方法,对S-腺苷甲硫氨酸代谢途径中的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）基因、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-γECS）基因在正常供水、PEG-6000模拟水分胁迫和复水过程中小麦叶片的表达模式进行了分析。结果表明,3个基因在正常生长情况下有一定量的表达,SAMS和SAMDC基因在水分胁迫早期（PEG-6000胁迫6、12、244、8 h）上调表达,水分胁迫后期（PEG-6000胁迫75 h）表达量下降;复水后3~6 h上调表达,复水9 h后表达量下调至对照水平。-γECS基因在水分胁迫阶段呈上调表达,复水后表达量下调至对照水平。可见,小麦SAMS、SAMDC和-γECS基因的表达都受水分胁迫诱导,同时,SAMS与SAMDC基因还参与水分胁迫后的复水调节,说明S-腺苷甲硫氨酸代谢途径在小麦抗旱节水中具有重要作用。

酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因工程菌 ,为酶促转化法生产S 腺苷甲硫氨酸奠定基础。方法 应用PCR技术从S 腺苷甲硫氨酸高产酿酒酵母染色体DNA中扩增得到S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因sam2 ,将其克隆至表达载体pT7 7,转化大肠杆菌 ,1%琼脂糖电泳比较大小 ,筛选重组子。结果 SDS PAGE显示重组菌S 腺苷甲硫氨酸合成酶亚基分子量约为 4 2KDa ,平均表达量约占菌体总可溶性蛋白的 4 2 % ,酶活达到 14 .1U/g湿菌体 ,比宿主菌酶活提高 15 .7倍。结论 酿酒酵母SAM合成酶基因在大肠杆菌中高效表达 。

棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及低温下的表达分析

根据棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosy lmethionine decarboxylase,SAMDC)基因已知EST序列设计引物,采用RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为GhSAMDC(GenBank登录号为JN020148)。生物信息学分析表明,GhSAMDCcDNA序列全长1874bp,涵盖tiny ORF(tORF)、upstream ORF(uORF)和main ORF(mORF)3个植物SAMDC基因特征ORF。其中mORF长1064bp,编码含355个氨基酸残基的SAMDC酶原,预测分子量为38.25kD,该酶原含有高度保守的酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和与SAMDC蛋白快速降解有关的PEST(TIHVTPEDGFSYAS)结构域。GhSAMDC基因组DNA序列全长2743bp,包含3个内含子,均位于5'UTR,其中一个位于uORF内。聚类分析表明,GhSAMDC与葡萄中该蛋白的同源关系最近,并且与其他双子叶植物聚为一类。荧光定量PCR分析结果表明,GhSAMDC表达受低温诱导,在冷敏感品种新陆早1号中基因表达水平明显高于在耐冷品种新陆早33中。

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H2O2胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。

S-腺苷甲硫氨酸的研究进展

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是甲硫氨酸和三磷酸腺苷相结合的代谢物,广泛存在于动植物和微生物体内,参与40多种生化反应,主要作为三种代谢途径(转甲基、转硫基、转氨丙基)的前体,临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。SAM的制备方法主要有化学合成法、酶促合成法、发酵法三种。化学合成的SAM是消旋体,需进行光学拆分,且存在产率低、原料L-高半胱氨酸价格昂贵和环境污染等问题。酶促合成法合成的SAM纯度高,但原料ATP成本太高。发酵法已成为目前生产SAM最常用的方法,欧洲利用发酵法生产SAM已实现了产业化,但国内的起步较晚,目前还处于实验室研究阶段。因此,应加强发酵法生产SAM的产业化关键技术研究。

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA,利用GeneRacerTMKit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接,反转录合成cDNA,以cDNA为模板,分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物,进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp,编码393个氨基酸,与其它物种的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79％-82％之间,氨基酸序列同源性在88％-91％之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因。

玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因家族成员在盐胁迫条件下的差异表达

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶,催化甲基供体和化合物前体S-腺苷甲硫氨酸的合成。为研究S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在盐胁迫条件下的响应和功能,以玉米甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参基因,通过半定量RT-PCR法分析玉米SAMS基因在盐胁迫条件下的表达模式。结果表明,玉米SAMS基因家族4个成员(SAMS1、SAMS2、SAMS3和SAMS4)在正常生长(对照)和盐胁迫条件下都表达,对照根茎中的表达量大于叶中。SAMS1受盐胁迫后,茎中表达量降低,而叶中表达量略有增加,根中无明显变化。SAMS2和SAMS4受盐胁迫明显诱导,而SAMS3似乎不受盐胁迫诱导,处理植株与对照株相比均无差异。说明玉米SAMS基因家族的4个基因在表达模式上存在差异,推测在功能上存在分工的不同。

大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达

应用PCR技术从E.coli JM 109中扩增出长约1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，将其插入高表达载体pET11c的NdeI和BamHI位点中，转化E.coli BL 21 (DE3)。SDS-PAGE和薄层扫描结果表明，重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达量占菌体总可溶性蛋白含量的58.3%。酶活测定结果表明，重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活力比宿主菌高7倍。