S-腺苷高半胱氨酸水解酶在甲基循环中的代谢调节

S-腺苷高半胱氨酸水解酶(Adohcyase)广泛存在生物体内,其功能主要是催化细胞S-腺苷高半胱氨酸(Adohcy)可逆水解生成腺苷(Ado)和高半胱氨酸(Hcy)。论文主要阐述了S-腺苷高半胱氨酸水解酶在真核生物细胞中调节S-腺苷高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、腺苷、高半胱氨酸的代谢途径和S-腺苷高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺的代谢途径,以及酶在控制细胞中S-腺苷高半胱氨酸水平和调节甲基循环中的代谢作用和其应用研究近况。

黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的cDNA,并进行生物信息学和表达分析,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选,采用RT-PCR和电子克隆技术,获得黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长序列(NCBI编号:HQ444960,CsSAHH)。运用半定量RT-PCR,分析CsSAHH基因在乙烯利诱导后的茎尖和雌雄花不同部位的表达。通过生物信息学方法预测CsSAHH基因的蛋白结构。【结果】黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长1 545 bp,编码485个氨基酸,其理论上的等电点pI=5.66,分子量MW=53.1 kD。CsSAHH基因在黄瓜茎尖受乙烯利诱导增强表达,在黄瓜雄花中的雄蕊表达较弱。CsSAHH理化性质表明,该蛋白无明显的信号肽;蛋白二级结构主要由loop环和α螺旋构成,含少量的β折叠,预测发现该蛋白分别在85—99氨基酸残基和262—279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。CsSAHH基因氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%,与水稻、玉米、拟南芥等作物同源性较低。【结论】成功克隆黄瓜CsSAHH基因cDNA序列,在85—99氨基酸残基和262—279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。该基因在茎尖受乙烯利诱导增强表达,在雄蕊中表达较弱。在未处理的雌雄花芽发育不同阶段,雌花芽中表达强于幼果和雄花芽。

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的克隆和序列分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(SAHH)全长cDNA序列设计引物,以草菇基因组DNA为模板,PCR扩增获得草菇SAHH基因的全长序列,序列分析结果表明,草菇SAHH长度为1868bp,编码430个氨基酸残基,基因由12个外显子和11个内含子组成,将草菇SAHH基因推断的氨基酸序列与其它物种的SAHH基因氨基酸序列进行比较发现,SAHH基因保守性较高。

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶同源基因Cor3低温条件下的表达变化

将草菇(Volvariella volvacea)菌株V23和耐低温诱变菌株VH3的菌丝体在4℃下处理不同时间后,采用荧光定量PCR技术中的双标准曲线法研究了S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶同源基因Cor3的表达变化。结果显示,低温处理后,草菇V23菌株的Cor3基因表达量随处理时间的延长呈不断下降趋势,10h时,其表达量仅为对照的7%。而VH3菌株Cor3基因4℃处理2h表达量明显上升,为对照的1.8倍,处理4h和6h表达量降低,分别为对照的80%和90%,处理8h的表达量又上升,为对照的1.4倍,随后下降,处理10h表达量最低,为对照的60%。根据结果初步推测Cor3基因与草菇低温耐受性具有一定相关性。

S-腺苷高半胱氨酸水解酶及其抑制剂的研究近况

综述近年来国内外有关S-腺苷高半胱氨酸水解酶分子水平的催化机制及其抑制剂的作用机制研究和产品开发状况。S-腺苷高半胱氨酸水解酶是大多数病毒复制所依赖的细胞酶,它作为广谱抗病毒药物设计的重要靶点,已引起科学家们的广泛关注,其抑制剂的开发目前主要围绕对腺苷类似物的结构改造,以获得高活性、低毒性的抗病毒新药。

S-腺苷高半胱氨酸水解酶的晶体结构及其催化机制

AdoHcy水解酶是一重要的广谱抗病毒药物靶标,对其结构,特别是三维空间结构的研究,有助于深入了解和阐述其功能,并为实现基于靶标结构的药物设计和筛选奠定基础。该文介绍近年来有关AdoHcy水解酶晶体结构的研究成果。

酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻cDNA文库中与S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白

目的:应用酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻c DNA文库中能与S-腺苷高半胱氨酸水解酶(ds SAHH)相互作用的蛋白。方法:将构建好的p GBKT7-ds SAHH诱饵载体转化至酵母细胞Y187,与转化有杜氏盐藻c DNA文库的酵母细胞AH109杂交,从杜氏盐藻c DNA文库中筛选出能与ds SAHH相互作用的蛋白质。扩增所得基因片段全长,并在原核内表达该融合蛋白。随后采用Far-western blot、His pull-down及免疫共沉淀方法验证ds SAHH与目的蛋白在体内、外的相互作用。结果:以ds SAHH为诱饵筛选出3个阳性克隆,扩增得到dsRACK1、ds Met AP1和dse EF1α3个新基因。His pull-down和免疫共沉淀体内外实验证实dsRACK1能与ds SAHH相互作用。结论:dsRACK1是ds SAHH的相互作用蛋白。

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因上游序列的克隆和分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(sahh)全长序列设计两个嵌套引物,与Takara LA PCR in vitro cloning试剂盒的接头引物结合进行巢式PCR扩增,得到sahh上游调控序列,通过序列分析发现,该序列含有1个TATA盒和4个CAAT盒。应用MatInspector程序分析sahh上游调控序列,发现该区域存在1个耐盐因子,1个热激因子,2个DRE元件和2个ABA应答元件。

落地生根S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及生物信息学分析

为了解落地生根（Kalanchoe daigremontiana）的SAHH基因功能，采用RACE技术从其叶片克隆了SAHH的全长cDNA序列，命名为KdSAHH。结果表明，KdSAHH全长为1748 bp，含1458 bp完整的开放阅读框（ORF），推测编码485个氨基酸。预测落地生根SAHH蛋白分子量约为53 kDa，理论等电点为5.59~5.682。Scanprostie和DNAstar预测表明，落地生根SAHH蛋白在进化上非常保守，与苜蓿的亲缘关系较近。以黄羽扇豆为模板，利用SWISS-MODLE和Phyre程序模拟的落地生根SAHH蛋白亚基三维结构有一定差异。这些为落地生根KdSAHH的表达和功能研究奠定了基础。

毛白杨S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因PtSAHHA的克隆、表达及SNP关联分析

组合运用分子生物学及生物信息学方法,首次从毛白杨成熟木质部中分离出编码S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因PtSAHHA的cDNA克隆。序列分析表明,毛白杨PtSAHHA cDNA片段全长为1 935 bp,其内部含有大小为1 458 bp的完整开放阅读框架,可编码含有485个氨基酸残基的蛋白质。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSAHHA在木质部中表达丰度最高,在形成层和老叶中表达丰度中等,在嫩叶中表达丰度最低。在此基础上,组合利用MAGE5.0和DnaSP5软件对毛白杨自然群体中45株基因型个体的PtSAHHA序列进行对比和分析,共检测到166个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/15 bp,多样性指数πT为0.010 58。在外显子区域共检测到88个SNP位点,其中同义突变位点34个,错义突变位点53个及1个无义突变位点;同义突变的核苷酸多样性πSynonymous=0.024 91,是非同义突变核苷酸多样性πNonsynonymous=0.002 33的10倍,推测毛白杨PtSAHHA基因编码区在毛白杨物种演化过程中受到较强的纯化选择压力。对PtSAHHA基因内的SNPs连锁不平衡分析结果表明,随着核苷酸序列长度增加至800 bp,即r2<0.1,SNPs的连锁不平衡水平已衰退至不明显。在此基础上,在由426株毛白杨基因型个体组成的关联作图群体内,对频率大于10%的42个常见SNP标记位点与6个木材品质性状进行关联分析,检测到3个SNP标记与3个表型性状显著关联。研究结果为基于分子标记的毛白杨优良木材品质性状定向辅助育种提供理论依据。

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因表达载体的构建及表达纯化

为了在原核细胞中表达青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtaunese S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adeno-sylhom ocysteine hydrolase,SAHH),采取构建文昌鱼SAHH基因的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-SAHH的方法,转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中,IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果经SDS-PAGE分析,重组质粒在JM109中表达并纯化得到的融合蛋白大约为70kDa,成功构建了文昌鱼SAHH基因原核表达载体,且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白。

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的组织特异性表达

为了探索文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶AdoHcyase基因在文昌鱼组织中的表达分布情况,利用组织原位杂交技术,以地高辛标记的反义RNA为探针,检测了文昌鱼AdoHcyase基因在组织中的表达分布特点。结果表明,AdoHcyase基因在雌性文昌鱼的卵巢、肝盲囊和后肠杂交信号十分强烈,在内柱、鳃等组织中也有微弱信号表达,而精巢、肌肉、脊索等组织中没有阳性信号。结果初步表明,文昌鱼AdoHcyase的功能是动物AdoHcyase的基本功能,与卵母细胞的成熟和肝脏的功能有关。本实验为以文昌鱼作为模式生物开发用于抑制AdoHcyase的低毒性药物提供了依据。

S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶及其抑制剂的研究进展

S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(SAHase)是目前唯一已知催化S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)可逆水解成高半胱氨酸和腺苷的酶,SAH是所有依赖S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的生物甲基转移反应的产物。SAHase抑制剂可以通过抑制SAH的催化水解,反馈性抑制SAM介导的甲基化过程从而抑制病毒m RNA的复制转录。近年来,SAHase已成为药物设计的热门靶标,SAHase抑制剂已表现出抗病毒、免疫抑制、抗肿瘤、抗菌等多种药理活性,SAHase抑制剂也取得了较大的进展,本文就近年来报道的SAHase及其抑制剂进行综述。

一种S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶活性的检测方法

通过PCR扩增获得了S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(SAHN)和S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的基因序列,克隆入表达载体,转化宿主细胞,表达纯化得到带有组氨酸标签的重组蛋白,基于SAHN和SRHH重组酶建立了一种酶偶联分析S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶活性的检测方法.甲基转移酶的共同产物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)首先被SAHN酶水解生成腺嘌呤和S-核苷高半胱氨酸,后者进一步被SRHH酶裂解生成高半胱氨酸,最后高半胱氨酸与Ellman’s试剂反应生成5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB).实验结果表明,重组表达获取的2种酶蛋白均具有良好的催化活性,酶偶联反应生成的TNB与初始AdoHcy浓度呈现显著的线性正相关.该检测方法克服了S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶的共同产物AdoHcy的反馈抑制,使甲基化反应进行完全,从而保证了对甲基转移酶活性准确有效的定量分析.

高效液相色谱法测定1，4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸原料及制剂中的有关物质

目的建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定1,4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸原料及注射用灭菌粉末中4种有关物质。方法色谱柱:Supelcosil LC-SCX强阳离子交换色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:0.1mol·L-1甲酸铵溶液(用甲酸调节pH值至2.8),柱温:30℃,流速:1.0mL·min-1,检测波长:260nm。结果1,4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸峰与各杂质峰均能良好分离。杂质腺苷、腺嘌呤、S-腺苷-L-高半胱氨酸和甲硫腺苷的浓度分别在0.96～19.27,0.95～18.93,1.03～20.64和2.11～42.16μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,回收率分别为100.6%,100.1%,98.2%和99.3%,RSD分别为1.3%,0.8%,0.5%和1.1%(n=12)。结论该方法灵敏、准确,专属性好,可用于1,4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸原料和制剂中有关物质的检查。

解淀粉芽孢杆菌mtnN基因对其生物合成S-腺苷甲硫氨酸的影响

为探索解淀粉芽孢杆菌中mtnN基因编码的S-腺苷高半胱氨酸核苷酶对S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)合成的影响,通过基因敲除技术和反义RNA抑制技术构建了针对mtnN基因的系列工程菌株。与出发菌株HZ-12相比,缺失mtnN基因的菌株SAM产量和生物量分别下降了51%和26%,说明完全阻断该基因不利于菌体的生长和产物的合成。进一步通过反义RNA微调抑制mtnN基因的表达,与对照菌株HZ-12/pHY300相比,所构建的反义RNA工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHYmtnNasRNA-3生物量没有显著性变化,且其SAM产量分别达到14.58、12.27 mg/L和12.49 mg/L,相比对照分别提高了44%、22%和24%。本研究不仅阐释了mtnN基因对SAM合成的影响规律,而且为SAM高产工程菌株的构建提供了新的思路。

真菌Mucor amphibiorum RCS1中一个类S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的蓝光诱导表达

【目的】确定真菌Mucor amphibiorum RCS1中一个类S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase-like,sahhl)受蓝光诱导表达。【方法】以真菌M.amphibiorum RCS1为研究对象,在随机PCR过程中从中获得了一段555 bp长度的DNA序列。以地高辛对这段已知序列进行标记制备探针,通过Northern杂交检测M.amphibiorum RCS1菌丝体培养过程中,由黑暗到蓝光再到黑暗这一光照条件改变的情况下,sahhl基因的转录情况。同时结合应用real-time PCR方法进行分析检测。【结果】经过比对确定这段555bp序列与已经发表的人(Homo sapiens)、家鼠(Mus musculus)和部分真菌的S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因sahh有较高的同源性。因此,初步确认这段mRNA序列来自M.amphibiorum RCS1的一个类S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因。sahhl基因在黑暗预培养24 h的情况下,蓝光诱导24 h时通过Northern杂交和real-time PCR均可从菌丝体中检测到sahhl基因的大量转录。但sahhl基因在黑暗预培养48 h的情况下,通过real-time PCR没有检测到sahhl基因的大量表达。【结论】上述结果说明,蓝光可以诱导M.amphibiorum RCS1中生长旺盛的菌丝体中sahhl基因的表达。

阻断消耗途径提高毕赤酵母工程菌S-腺苷甲硫氨酸产量

【背景】S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)作为所有生物体内的重要中间代谢物,不仅可作为膳食补充剂,还具有良好的临床应用价值。【目的】将毕赤酵母重组菌GS115/DS16的SAM消耗途径阻断,进一步提高SAM的产量。【方法】分别敲除毕赤酵母重组菌GS115/DS16的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因sah1、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因spe2和L-甲硫氨酰tRNA合酶基因msm1,构建工程菌G/Dsah、G/Dspe和G/Dmsm。检测3个工程菌的生长和SAM产量,以及L-Met添加量对SAM积累的影响。【结果】与出发菌GS115/DS16相比,工程菌G/Dsah、G/Dspe和G/Dmsm的单位菌体SAM产量分别提高了29.3%、55.6%和24.8%,其生长无显著差异。L-Met添加量优化后(0.06%),G/Dsah和G/Dmsm单位菌体的SAM产量分别提高了26.4%和28.9%。【结论】构建的毕赤酵母工程菌可用于SAM的工业化生产,该代谢工程策略可用于改进其他化学品的生产。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1对慢性帕金森病小鼠模型黑质中酪氨酸羟化酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3表达的影响

目的探讨烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)对慢性帕金森病(PD)小鼠模型(C57BL/6小鼠)黑质中酪氨酸羟化酶(TH)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)表达的影响。方法利用重组慢病毒转染1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)制备慢性PD小鼠模型。依据不同处理方式分为3组:对照组[经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射空白对照重组慢病毒(LV-GFP),1周后腹腔注射生理盐水];MPTP组(经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射LVGFP,1周后建立MPTP慢性PD模型);NMNAT1组[经立体定位仪向小鼠双侧黑质注射NMNAT1基因的过表达重组慢病毒(LV-NMNAT1),1周后建立MPTP慢性PD模型]。采用Western blot法检测3组小鼠黑质中TH及caspase-3半定量表达水平。结果 NMNAT1呈高表达的NMNAT1组黑质中TH蛋白表达量较MPTP组高(t=7.985,P<0.001),caspase-3蛋白表达量较MPTP组低(t=8.901,P<0.001)。结论 NMNAT1能增加TH表达发挥一定的神经保护作用,并通过减少caspase-3表达水平参与抗细胞凋亡。

铜离子抑制腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性

利用 E.coli JM109菌株高效表达和纯化了重组人的 S-腺苷同型半胱氨酸（AdoHcy）水解酶.初步研究了铜离子对AdoHcy水解酶活性的影响.结果表明,Cu2+可以抑制酶的活性,其抑制能力随着Cu2+浓度增加而增大;Cu2+对 AdoHcy水解酶活性抑制是一个时间依赖的过程,其表观速率常数为（1.08±0.15）min-1.自然底物腺普（AdoHcy）的存在可以明显减弱 Cu2+抑制酶活性的能力。研究结果表明,Cu2+可能与酶的自然底物以某种类似方式竞争结合,从而抑制酶的活性.