草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的克隆和序列分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(SAHH)全长cDNA序列设计引物,以草菇基因组DNA为模板,PCR扩增获得草菇SAHH基因的全长序列,序列分析结果表明,草菇SAHH长度为1868bp,编码430个氨基酸残基,基因由12个外显子和11个内含子组成,将草菇SAHH基因推断的氨基酸序列与其它物种的SAHH基因氨基酸序列进行比较发现,SAHH基因保守性较高。

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶同源基因Cor3低温条件下的表达变化

将草菇(Volvariella volvacea)菌株V23和耐低温诱变菌株VH3的菌丝体在4℃下处理不同时间后,采用荧光定量PCR技术中的双标准曲线法研究了S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶同源基因Cor3的表达变化。结果显示,低温处理后,草菇V23菌株的Cor3基因表达量随处理时间的延长呈不断下降趋势,10h时,其表达量仅为对照的7%。而VH3菌株Cor3基因4℃处理2h表达量明显上升,为对照的1.8倍,处理4h和6h表达量降低,分别为对照的80%和90%,处理8h的表达量又上升,为对照的1.4倍,随后下降,处理10h表达量最低,为对照的60%。根据结果初步推测Cor3基因与草菇低温耐受性具有一定相关性。

南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因的克隆及其生物信息学分析

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,SAHH)是一种细胞内广泛存在的酶,在调节生物体转甲基化反应中占据重要地位。本研究通过RT-PCR及RACE-PCR技术克隆了南极冰藻(Chlamydomonas sp.ICE-L)S-腺苷同型半胱氨酸水解酶全序列,命名为ICE-LSAHH。ICE-LSAHH全长1 844 bp,包括5′非编码区36 bp,3′非编码区344 bp,含有一个较长的poly(A)尾。开放阅读框1 461 bp,编码487个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其分子量为53.0 kD,理论等电点为5.16。SignalP 3.0、TMHMM Server v.2.0、NetNGlyc 1.0和NetPhos 2.0预测结果显示,ICE-LSAHH蛋白不存在信号肽与跨膜区,含有1个N-糖基化位点及23个磷酸化位点。利用ClastalX 2.0及MEGA 5.0软件,以邻位相连法对南极冰藻及其他物种SAHH构建系统进化树,结果显示,ICE-LSAHH与杜氏盐藻(Dunaliella salina)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小球藻(Chlorella variabilis)等有较近亲缘关系。利用SWISS-MODEL程序和PyMOL Viewer软件成功模拟了ICE-LSAHH蛋白亚基的三维结构,该结构包括20个α-螺旋和12个β-折叠,且存在3个结构域:N端底物结合域、NAD结合域和C端域。可见,SAHH基因存在于南极冰藻并进行了有效的表达,该蛋白定位于细胞质,进一步证实SAHH是一个进化上比较保守的蛋白。

南极嗜冷假单胞菌7197S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)基因的克隆与序列分析

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株耐冷菌株7197,其16S rDNA序列分析表明该菌株属于假单胞菌属(Pseu-domonas)。作者通过设计引物,从该菌的全基因组DNA中克隆到编码S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAHH)的完整ORF,全长为1424bp。使用DNAMAN(5.1)软件对全长ORF为1424bp的SAHH基因进行分析,SAHH基因编码一个由474AA残基组成、分子量预计为52523 Da的SAHH蛋白质,与Psychrobacter sp.273-4的SAHH有96.84%的相似性;与Acinetobacter sp.ADP1的SAHH有79%的相似性;与Pseudomonas fluorescens Pf-5的SAHH有75%的相似性。

编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的草菇冷诱导基因Cor3功能验证

将草菇(Volvariella volvacea)冷诱导基因Cor3cDNA序列经EcoR I酶切克隆到原核表达载体pPROK-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达、分离纯化发现该蛋白的分子量约为43kD,等电聚焦电泳结果表明,该蛋白的等电点为6.1,HPLC检测说明合成方向的酶活性为每毫克蛋白每分钟4.5μmol,DNTB与同型半胱氨酸颜色反应测定水解方向的酶活性为每毫克蛋白每分钟0.7μmol,根据上述特性可以确定草菇冷诱导基因Cor3所编码的蛋白是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)。

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因上游序列的克隆和分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(sahh)全长序列设计两个嵌套引物,与Takara LA PCR in vitro cloning试剂盒的接头引物结合进行巢式PCR扩增,得到sahh上游调控序列,通过序列分析发现,该序列含有1个TATA盒和4个CAAT盒。应用MatInspector程序分析sahh上游调控序列,发现该区域存在1个耐盐因子,1个热激因子,2个DRE元件和2个ABA应答元件。

落地生根S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及生物信息学分析

为了解落地生根（Kalanchoe daigremontiana）的SAHH基因功能，采用RACE技术从其叶片克隆了SAHH的全长cDNA序列，命名为KdSAHH。结果表明，KdSAHH全长为1748 bp，含1458 bp完整的开放阅读框（ORF），推测编码485个氨基酸。预测落地生根SAHH蛋白分子量约为53 kDa，理论等电点为5.59~5.682。Scanprostie和DNAstar预测表明，落地生根SAHH蛋白在进化上非常保守，与苜蓿的亲缘关系较近。以黄羽扇豆为模板，利用SWISS-MODLE和Phyre程序模拟的落地生根SAHH蛋白亚基三维结构有一定差异。这些为落地生根KdSAHH的表达和功能研究奠定了基础。

毛白杨S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因PtSAHHA的克隆、表达及SNP关联分析

组合运用分子生物学及生物信息学方法,首次从毛白杨成熟木质部中分离出编码S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因PtSAHHA的cDNA克隆。序列分析表明,毛白杨PtSAHHA cDNA片段全长为1 935 bp,其内部含有大小为1 458 bp的完整开放阅读框架,可编码含有485个氨基酸残基的蛋白质。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSAHHA在木质部中表达丰度最高,在形成层和老叶中表达丰度中等,在嫩叶中表达丰度最低。在此基础上,组合利用MAGE5.0和DnaSP5软件对毛白杨自然群体中45株基因型个体的PtSAHHA序列进行对比和分析,共检测到166个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/15 bp,多样性指数πT为0.010 58。在外显子区域共检测到88个SNP位点,其中同义突变位点34个,错义突变位点53个及1个无义突变位点;同义突变的核苷酸多样性πSynonymous=0.024 91,是非同义突变核苷酸多样性πNonsynonymous=0.002 33的10倍,推测毛白杨PtSAHHA基因编码区在毛白杨物种演化过程中受到较强的纯化选择压力。对PtSAHHA基因内的SNPs连锁不平衡分析结果表明,随着核苷酸序列长度增加至800 bp,即r2<0.1,SNPs的连锁不平衡水平已衰退至不明显。在此基础上,在由426株毛白杨基因型个体组成的关联作图群体内,对频率大于10%的42个常见SNP标记位点与6个木材品质性状进行关联分析,检测到3个SNP标记与3个表型性状显著关联。研究结果为基于分子标记的毛白杨优良木材品质性状定向辅助育种提供理论依据。

S-腺苷同型半胱氨酸升高与人脐静脉内皮细胞损伤及整体基因组甲基化的关系分析

目的:探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)升高对血管内皮细胞的损伤效应与整体基因组甲基化的关系。方法:以永生化的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)为研究对象,用不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)抑制剂3-deazaadenosine(DZA)处理24、48、72h,使用光学显微镜观察细胞形态学变化,电子显微镜观察细胞器超微结构变化,反相高效液相色谱法(reversed phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定胞内SAH浓度,荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)测定Hcy的浓度,MTT法检测细胞生长增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,胞嘧啶延伸法检测整体基因组DNA甲基化水平。结果:HUVEC经DZA处理后,形态学上出现凋亡或坏死特征,培养基中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)浓度下降,胞内SAH含量升高,细胞的生长增殖能力降低并出现凋亡现象,整体基因组的甲基化水平降低。结论:SAH升高能导致血管内皮细胞的损伤,且这种作用与整体基因组甲基化水平有关,SAH可能是动脉粥样硬化形成过程中的潜在生物标志分子。

S-腺苷高半胱氨酸水解酶在甲基循环中的代谢调节

S-腺苷高半胱氨酸水解酶(Adohcyase)广泛存在生物体内,其功能主要是催化细胞S-腺苷高半胱氨酸(Adohcy)可逆水解生成腺苷(Ado)和高半胱氨酸(Hcy)。论文主要阐述了S-腺苷高半胱氨酸水解酶在真核生物细胞中调节S-腺苷高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、腺苷、高半胱氨酸的代谢途径和S-腺苷高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺的代谢途径,以及酶在控制细胞中S-腺苷高半胱氨酸水平和调节甲基循环中的代谢作用和其应用研究近况。

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖中作用机制的研究

目的探讨S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl hom ocysteine;SAH)水解酶(SAH H)在同型半胱氨酸(H om ocysteine;H cy)致平滑肌细胞增殖中的作用机制。方法原代培养平滑肌细胞(VSM C s),用0、50、100、200、500μM浓度H cy干预VSM C s,高效液相色谱法(H PLC)检测S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylm ethionine,SAM)和SAH含量的变化;实时R T-PC R和W estern blot检测SAH H表达的变化;M TT法检测H cy对VSM C s增殖的影响。结果 H PLC结果表明,VSM C s与0、50、100、200、500μM H cy培养72 h后,细胞中SAH的含量明显增加,而细胞中SAM的含量和SAM/SAH的比值下降,与对照组比较,差异均有显著性(P<0.05),实时R T-PC R和W estern blot结果显示,SAH H m R N A和蛋白水平下降,与对照组比较差异有显著性(P<0.05),M TT显示,在50μM H cy组,VSM C s数量明显增加,而100、200、500μM H cy组VSM C s数量反较对照组减少。结论 SAH H表达下调致使SAM/SAH的比值下降可能是H cy引起VSM C s增殖的重要机制之一。

以S-腺苷同型半胱氨酸水解酶为潜在靶点的新药研究进展

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)是细胞内广泛存在的一种酶,它催化S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)水解生成腺苷和同型半胱氨酸。抑制SAHH将导致细胞内甲基化抑制物AdoHcy的堆积,从而对转甲基反应产生反馈性抑制作用。而甲基化对于维持细胞的活性是必需的。鉴于SAHH在调节生物体转甲基化反应中的核心地位,它已被选择作为多种新药研发的重要靶点,包括免疫抑制剂、抗病毒药、防治动脉粥样硬化和阿尔茨海默病药物。SAHH抑制剂全新的化学结构、良好的作用效果和独特的作用靶点已引起国内外研究者广泛的兴趣。

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析

目的:探讨杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)基因在鞭毛再生中的作用。方法:通过设计简并引物及RACE法克隆了杜氏盐藻SAHase基因全长,使用pH休克法对杜氏盐藻进行鞭毛去除及再生,通过实时荧光定量PCR研究在转录水平上SAHase基因的变化。结果:所克隆的杜氏盐藻SAHase基因cDNA全长1926bp,包含ORF1458bp、3’UTR61bp和5’UTR407bp。实时荧光定量PCR结果显示,在鞭毛再生的过程中,SAHasemRNA转录量升高,其水平在3h时达到了未处理组的3倍左右。结论:杜氏盐藻的SAHase基因与鞭毛再生有关。

黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的cDNA,并进行生物信息学和表达分析,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选,采用RT-PCR和电子克隆技术,获得黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长序列(NCBI编号:HQ444960,CsSAHH)。运用半定量RT-PCR,分析CsSAHH基因在乙烯利诱导后的茎尖和雌雄花不同部位的表达。通过生物信息学方法预测CsSAHH基因的蛋白结构。【结果】黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长1 545 bp,编码485个氨基酸,其理论上的等电点pI=5.66,分子量MW=53.1 kD。CsSAHH基因在黄瓜茎尖受乙烯利诱导增强表达,在黄瓜雄花中的雄蕊表达较弱。CsSAHH理化性质表明,该蛋白无明显的信号肽;蛋白二级结构主要由loop环和α螺旋构成,含少量的β折叠,预测发现该蛋白分别在85—99氨基酸残基和262—279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。CsSAHH基因氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%,与水稻、玉米、拟南芥等作物同源性较低。【结论】成功克隆黄瓜CsSAHH基因cDNA序列,在85—99氨基酸残基和262—279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。该基因在茎尖受乙烯利诱导增强表达,在雄蕊中表达较弱。在未处理的雌雄花芽发育不同阶段,雌花芽中表达强于幼果和雄花芽。

Sirt1对糖尿病心肌病大鼠早期心肌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的调节作用及其机制研究

目的:通过建立糖尿病大鼠模型,探讨沉默信息调节因子(Sirt1)对S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)糖尿病心肌病早期的调节作用及其机制。方法:采用高脂饮食联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,分为对照组、早期糖尿病模型组(DM组)和白藜芦醇处理组(RES组),RES组给予白藜芦醇2.5 mg/(kg·d)灌胃2周处理。HE染色法观察心肌组织病理结构变化,超声心动图检测心功能相关指标,高效液相色谱法检测同型半胱氨酸(Hcy)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)及S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),Western blot检测各组心肌组织SAHH、Srit1等蛋白表达变化。结果:显微镜下DM组大鼠心肌组织可见不同程度炎细胞浸润、甚至变性,而RES组心肌组织可见少量炎性细胞浸润,少量心肌细胞呈长杆状,坏死灶不明显,嗜酸性变较DM组轻。HPLC检测结果显示对照组、DM组和RES组的Hcy分别为(45.37±7.99)、(101.78±16.77)和(86.33±10.09)μmol/L,DM组和RES组较对照组升高,但RES组低于DM组;SAH分别为(50.33±7.34)、(22.92±4.32)和(33.45±7.88)μmol/L,DM组和RES组较对照组降低,但RES组高于DM组;SAM分别为(66.34±9.99)、(69.56±9.01)和(70.89±11.33)μmol/L,各组间无显著差异;SAHH分别为(44.11±5.17)、(92.33±17.56)和(19.73±4.07)μmol/L,DM组较对照组升高,RES组较对照组降低;Srit1分别为(80.12±10.09)、(29.11±3.91)和(107.32±13.24)μmol/L,DM组较对照组降低,RES组较对照组升高。结论:SAHH及下游Hcy等的表达可能是早期糖尿病心肌病发生发展的重要作用机制,而Sirt1对SAHH的表达调控作用可能起重要作用。

S-腺苷高半胱氨酸水解酶及其抑制剂的研究近况

综述近年来国内外有关S-腺苷高半胱氨酸水解酶分子水平的催化机制及其抑制剂的作用机制研究和产品开发状况。S-腺苷高半胱氨酸水解酶是大多数病毒复制所依赖的细胞酶,它作为广谱抗病毒药物设计的重要靶点,已引起科学家们的广泛关注,其抑制剂的开发目前主要围绕对腺苷类似物的结构改造,以获得高活性、低毒性的抗病毒新药。

S-腺苷高半胱氨酸水解酶的晶体结构及其催化机制

AdoHcy水解酶是一重要的广谱抗病毒药物靶标,对其结构,特别是三维空间结构的研究,有助于深入了解和阐述其功能,并为实现基于靶标结构的药物设计和筛选奠定基础。该文介绍近年来有关AdoHcy水解酶晶体结构的研究成果。

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因表达载体的构建及表达纯化

为了在原核细胞中表达青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtaunese S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adeno-sylhom ocysteine hydrolase,SAHH),采取构建文昌鱼SAHH基因的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-SAHH的方法,转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中,IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果经SDS-PAGE分析,重组质粒在JM109中表达并纯化得到的融合蛋白大约为70kDa,成功构建了文昌鱼SAHH基因原核表达载体,且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白。

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的组织特异性表达

为了探索文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶AdoHcyase基因在文昌鱼组织中的表达分布情况,利用组织原位杂交技术,以地高辛标记的反义RNA为探针,检测了文昌鱼AdoHcyase基因在组织中的表达分布特点。结果表明,AdoHcyase基因在雌性文昌鱼的卵巢、肝盲囊和后肠杂交信号十分强烈,在内柱、鳃等组织中也有微弱信号表达,而精巢、肌肉、脊索等组织中没有阳性信号。结果初步表明,文昌鱼AdoHcyase的功能是动物AdoHcyase的基本功能,与卵母细胞的成熟和肝脏的功能有关。本实验为以文昌鱼作为模式生物开发用于抑制AdoHcyase的低毒性药物提供了依据。

酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻cDNA文库中与S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白

目的:应用酵母双杂交技术筛选杜氏盐藻c DNA文库中能与S-腺苷高半胱氨酸水解酶(ds SAHH)相互作用的蛋白。方法:将构建好的p GBKT7-ds SAHH诱饵载体转化至酵母细胞Y187,与转化有杜氏盐藻c DNA文库的酵母细胞AH109杂交,从杜氏盐藻c DNA文库中筛选出能与ds SAHH相互作用的蛋白质。扩增所得基因片段全长,并在原核内表达该融合蛋白。随后采用Far-western blot、His pull-down及免疫共沉淀方法验证ds SAHH与目的蛋白在体内、外的相互作用。结果:以ds SAHH为诱饵筛选出3个阳性克隆,扩增得到dsRACK1、ds Met AP1和dse EF1α3个新基因。His pull-down和免疫共沉淀体内外实验证实dsRACK1能与ds SAHH相互作用。结论:dsRACK1是ds SAHH的相互作用蛋白。