S-腺苷甲硫氨酸逆转胰腺癌化疗耐药的作用及机制研究

目的研究S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)对胰腺癌化疗耐药的逆转作用并探讨相关机制。方法S SAM处理人胰腺癌耐药细胞株PANC-1/CEM后,MTT实验研究细胞增殖活性的变化以及对吉西他滨(gemcitabine,GEM)化疗耐药性的影响;流式细胞术探讨SAM对胰腺癌耐药细胞株调亡率的影响;细胞划痕实验分析SAM对耐药细胞株迁移活性能力的改变;Westernblot法检测耐药株中NEDD4-1蛋白的表达变化及SAM处理后细胞内NEDD4-1、P-JAK2、P-STAT3及P-gp蛋白水平的变化。结果SAM作用于胰腺癌PANC-1/CEM耐药细胞株后,可抑制细胞株的生长活力并可明显降低其对GEM化疗的耐药活性,ICso值由1557.50±201.10nmol/L降低至218.39±20.61nmol/L(P<0.01);SAM明显诱导耐药细胞株发生凋亡且可抑制其迁移的活性;耐药细胞株中NEDD4-1蛋白表达上调,且SAM可抑制耐药株中NEDD4-1、P-JAK2、P-STAT3及P-gp蛋白的活化水平。结论SAM可通过调控NEDD4-1抑制JAK2/STAT3通路活性并调控P-gp蛋白的活性降低PANC-1/CEM细胞对CEM的化疗耐药性,为后续SAM应用于临床治疗肿瘤患者的化疗耐药提供一定的实验依据。

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖的3-氨基-3-羧基丙基利用酶研究进展

S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是生物体内重要的辅因子。SAM的结构中具有3个不稳定的C-S键,不同的SAM依赖酶能够选择性地切割其中不同的C-S键来催化各种类型的反应。其中,利用SAM甲基部分的甲基转移酶和腺苷部分的SAM自由基酶被广泛研究。UniProt数据库中保存了超过1800000条SAM依赖的甲基转移酶序列;SAM自由基酶也已经成为最大的酶家族之一,数目超过700000个。但利用SAM中3-氨基-3羧基丙基(3-amino-3-carboxypropyl,ACP)的酶却报道相对较少,本文对目前这一类酶的研究进行分类介绍,并对这一领域未来研究方向进行展望。

S-腺苷L-甲硫氨酸对围产期暴露全氟辛烷磺酸大鼠生殖毒性的拮抗作用

目的探讨早期低剂量接触全氟辛烷磺酸盐(perfluorooctane sulfonate,PFOS)对大鼠生殖功能和生长发育的影响及S-腺苷L-甲硫氨酸(S adenosyl L methionine,SAM)和5-杂氯脱氧胞嘧啶(decitabine,DAC)对其的干预作用。方法将40只健康出生5 d(PND5)SPF级SD大鼠随机分为4组,每组10只,雌雄各半,分别为对照(0.2%Tween-80生理盐水)组、PFOS染毒组、SAM干预组和DAC干预组。PFOS染毒组、SAM干预组和DAC干预组分别染毒5 mg/kg的PFOS;SAM干预组和DAC干预组分别同时给与16 mg/kg的SAM和0.15 mg/kg的DAC干预;采用颈部皮下注射方式进行染毒,每天1次,28 d后,每3 d 1次,持续染毒至出生后60 d(PND60)。每天观察F0代大鼠的一般情况并测定体重。待F0代大鼠成年后,将雌、雄大鼠按1∶1合笼交配。待F1代大鼠成年后,各组选取6只大鼠,以雌∶雄为2∶1进行合笼,孕期和哺乳期(PND28)母鼠的染毒方法同前。观察各代大鼠的生育能力和仔鼠的发育情况,并观察F1代大鼠睾丸组织形态结构变化。结果与对照组比较,PFOS组、SAM干预组和DAC干预组F0代母鼠的受孕率均较低,死产率较高,存活率较低;PFOS组和DAC干预组F0代母鼠的畸胎率和产后死亡率均较高,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。与PFOS染毒组比较,SAM干预组F0代母鼠的受孕率、存活率较高,死产率、畸胎率较低;DAC干预组F0代母鼠的死产率、存活率较低,产后死亡率较高,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。与对照组比较,PFOS染毒组和DAC干预组F1代仔鼠出生体重均较低,毛发长出时间均延长,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);PFOS染毒组和SAM干预组、DAC干预组F1代仔鼠的开眼时间和自主采食出现时间均延长,差异有统计学意义(P<0.05),而耳廓伸展时间无明显改变。与PFOS染毒组比较,SAM干预组F1代仔鼠的出生体重较高,开眼时间和自主采食出现时间均缩短,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);DAC干预组F1代仔鼠出生体重、耳廓伸展时间、毛发长出时间、开眼时间和自主采食出现时间均无明显改变。与对照组比较,PFOS染毒组和DAC干预组、SAM干预组F1代雄性大鼠睾丸生精细胞层次减少和生精上皮细胞排列松散的异常生精小管百分比均增加,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与PFOS染毒组比较,SAM干预组F1代雄性大鼠睾丸生精细胞层次减少和生精上皮细胞排列松散的异常生精小管百分比均下降,差异均有统计学意义(P<0.05);而DAC干预组以上2指标均无明显变化。F1代仔鼠正常饲养两个月后,PFOS染毒组有2雄4雌仔鼠;DAC干预组有3雄4雌仔鼠,其雌鼠均未受孕;而SAM干预组有4雄4雌仔鼠,雌鼠均受孕,但均因难产死亡。结论围产期PFOS慢性暴露能引起大鼠生长发育迟缓,生育力下降,并遗传子代,致子代不孕不育,这与损害雄性大鼠的睾丸组织结构和生殖功能有关。DAC可进一步加重PFOS引起的生殖发育毒性,而SAM可明显抑制PFOS暴露产生的生殖毒性作用。影响体内甲基化代谢可能是干预PFOS的生殖毒性作用的新途径。

不同来源S-腺苷甲硫氨酸合酶在大肠杆菌中的表达及催化应用

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是一种重要的代谢中间体,对机体代谢活动的正常运行起重要作用,它是由底物L-甲硫氨酸和ATP在SAM合酶催化下生成的,目前主要应用于医药行业。该研究首先以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum基因组为模板扩增出SAM合酶编码基因BcmetK和CgmetK,以pETDueT1质粒为载体,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为底盘细胞,构建了SAM合成菌株E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK和E.coli BL21/pETDuet1-CgmetK。其次,针对SAM合成菌株全细胞催化合成体系条件进行了优化,重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度50 mmol/L、1.2%(体积分数)的OD_(600)值约9.0的细胞悬浮液、600 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO_(4)、100 mmol/L K_(2)SO_(4)、45℃、pH 8.0]下,连续转化5 h,获得了464 mg/L的SAM。重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-CgmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度40 mmol/L、0.8%(体积分数)的OD_(600)值约9.0的细胞悬浮液、800 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO 4、100 mmol/L K_(2)SO 4、45℃、pH 8.5]下,连续转化5 h,获得了528 mg/L的SAM,可见,谷氨酸棒杆菌来源的SAM合酶催化能力优于蜡状芽孢杆菌来源的,更有利于SAM的合成。该研究成功构建了SAM合成菌株,虽然产量水平不高,但为SAM的可持续生物合成提供了重要借鉴。

S-腺苷酰L-甲硫氨酸 (SAM)对 HL-60细胞 DNA甲基化酶活力和甲基化水平的影响(英文)

以 S-腺苷酰 - L-甲硫氨酸 (SAM)为诱导物 ,在 1 0 μmol/L最佳浓度下造成 1 6%的 HL- 60细胞分化 .HPLC检测结果表明 ,细胞基因组 DNA甲基化水平升高 .通过3H甲基同位素参入法研究细胞 DNA甲基化酶活力 ,则发现在细胞分化过程中酶活力未见升高 .说明细胞基因组甲基化水平升高并不是胞内 DNA甲基化酶催化能力改变的结果 ,而是由于 SAM进入细胞提供过量甲基造成的 .

HPLC-UV法定量测定发酵液中的S-腺苷-L-甲硫氨酸

采用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)定量测定发酵液中S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的含量。结果表明,S-腺苷-L-甲硫氨酸浓度在0.1～1.0g/L时,其峰面积(Y)与相应的浓度(X)呈线性关系,线性方程为Y=13.937X-0.1949,相关系数为0.9969。S-腺苷-L-甲硫氨酸的平均回收率为99.89%～101.7%,相对标准偏差为0.48%～1.36%。该方法精密度、准确度好,稳定性高,能简便、快速、准确地测定发酵液中S-腺苷-L-甲硫氨酸的含量。

发酵法制备S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究进展

S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)是甲硫氨酸和ATP相结合的代谢产物,广泛存在于动植物和微生物体内,参与40多种生化反应,临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。SAM制备方法包括化学合成法、微生物发酵法、体外酶促转化法以及全细胞催化法。详细阐述了SAM的微生物发酵制备方法的国内外研究现状。

高效液相色谱法分析胞内S-腺苷-L-甲硫氨酸含量及其合成酶活性的优化研究

对重组毕赤酵母胞内S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）含量以及SAM合成酶活性的高效液相色谱（HPLC）测定方法进行了优化。通过调整流动相浓度和洗脱程序,建立了保留时间适中、分离效果好的SAM定量分析方法。结果表明,SAM浓度在0.05~0.5 g.L-1时,其峰面积与浓度线性关系良好,相关系数为0.99996,平均回收率为99.3%~100.5%,相对标准偏差为0.72%~0.98%。该方法对胞内以及酶活测定液中的SAM能够进行有效分离,精密度高、稳定性好,能高效、准确地分析发酵过程菌体中SAM含量以及SAM合成酶活性。

热水提取酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究

研究了采用热水法直接提取酿酒酵母胞内产物S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)北京,并且通过实验对影响SAM抽提的5个条件:抽提温度、抽提时间、热水用量、搅拌转速、硫酸用量等进行了优化。得出的最佳实验条件为:温度70℃、每30 g湿菌体加入热水100 mL、硫酸浓度0.25 mol/L、搅拌转速160 r/min,此时SAM的抽提率可达91.5%。与其他方法相比,该方法耗时少、仪器简单、抽提液中S-腺苷-L-甲硫氨酸质量浓度高、经济且无污染。

S-腺苷甲硫氨酸研究进展

综述一种重要代谢中间物质 S-腺苷甲硫氨酸的体内代谢功能、制备、稳定化研究和临床应用进展。

烟草中一条新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用差异显示技术从烟草中分离到一个受乙烯利诱导表达的cDNA片段,结合RACE扩增技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1350个碱基,编码区有1170bp,通过GenBank同源性比较发现它与一条已知的烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS1,EC2.5.1.6)的基因编码区存在90%的同源性,编码的氨基酸顺序96%同源,而在cDNA的5'及3'非编码区同源性很低,且有一些短片段的缺失。设计合适的引物分别对这两个SAMS基因进行RT-PCR分析表明,SAMS1基因受高温诱导表达增强,但不受甲基紫晶诱导的氧化胁迫及盐胁迫影响,而新分离到的这个基因(SAMS2)的表达同时受高温、甲基紫晶及高盐3种胁迫的诱导。

S-腺苷甲硫氨酸代谢途径相关基因在小麦水分胁迫中的表达

以小麦品种‘晋麦47’为材料,利用半定量RT-PCR方法,对S-腺苷甲硫氨酸代谢途径中的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）基因、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-γECS）基因在正常供水、PEG-6000模拟水分胁迫和复水过程中小麦叶片的表达模式进行了分析。结果表明,3个基因在正常生长情况下有一定量的表达,SAMS和SAMDC基因在水分胁迫早期（PEG-6000胁迫6、12、244、8 h）上调表达,水分胁迫后期（PEG-6000胁迫75 h）表达量下降;复水后3~6 h上调表达,复水9 h后表达量下调至对照水平。-γECS基因在水分胁迫阶段呈上调表达,复水后表达量下调至对照水平。可见,小麦SAMS、SAMDC和-γECS基因的表达都受水分胁迫诱导,同时,SAMS与SAMDC基因还参与水分胁迫后的复水调节,说明S-腺苷甲硫氨酸代谢途径在小麦抗旱节水中具有重要作用。

酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因工程菌 ,为酶促转化法生产S 腺苷甲硫氨酸奠定基础。方法 应用PCR技术从S 腺苷甲硫氨酸高产酿酒酵母染色体DNA中扩增得到S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因sam2 ,将其克隆至表达载体pT7 7,转化大肠杆菌 ,1%琼脂糖电泳比较大小 ,筛选重组子。结果 SDS PAGE显示重组菌S 腺苷甲硫氨酸合成酶亚基分子量约为 4 2KDa ,平均表达量约占菌体总可溶性蛋白的 4 2 % ,酶活达到 14 .1U/g湿菌体 ,比宿主菌酶活提高 15 .7倍。结论 酿酒酵母SAM合成酶基因在大肠杆菌中高效表达 。

棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及低温下的表达分析

根据棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosy lmethionine decarboxylase,SAMDC)基因已知EST序列设计引物,采用RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为GhSAMDC(GenBank登录号为JN020148)。生物信息学分析表明,GhSAMDCcDNA序列全长1874bp,涵盖tiny ORF(tORF)、upstream ORF(uORF)和main ORF(mORF)3个植物SAMDC基因特征ORF。其中mORF长1064bp,编码含355个氨基酸残基的SAMDC酶原,预测分子量为38.25kD,该酶原含有高度保守的酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和与SAMDC蛋白快速降解有关的PEST(TIHVTPEDGFSYAS)结构域。GhSAMDC基因组DNA序列全长2743bp,包含3个内含子,均位于5'UTR,其中一个位于uORF内。聚类分析表明,GhSAMDC与葡萄中该蛋白的同源关系最近,并且与其他双子叶植物聚为一类。荧光定量PCR分析结果表明,GhSAMDC表达受低温诱导,在冷敏感品种新陆早1号中基因表达水平明显高于在耐冷品种新陆早33中。

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H2O2胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。

S-腺苷甲硫氨酸的研究进展

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是甲硫氨酸和三磷酸腺苷相结合的代谢物,广泛存在于动植物和微生物体内,参与40多种生化反应,主要作为三种代谢途径(转甲基、转硫基、转氨丙基)的前体,临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。SAM的制备方法主要有化学合成法、酶促合成法、发酵法三种。化学合成的SAM是消旋体,需进行光学拆分,且存在产率低、原料L-高半胱氨酸价格昂贵和环境污染等问题。酶促合成法合成的SAM纯度高,但原料ATP成本太高。发酵法已成为目前生产SAM最常用的方法,欧洲利用发酵法生产SAM已实现了产业化,但国内的起步较晚,目前还处于实验室研究阶段。因此,应加强发酵法生产SAM的产业化关键技术研究。

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA,利用GeneRacerTMKit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接,反转录合成cDNA,以cDNA为模板,分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物,进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp,编码393个氨基酸,与其它物种的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79％-82％之间,氨基酸序列同源性在88％-91％之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因。

玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因家族成员在盐胁迫条件下的差异表达

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶,催化甲基供体和化合物前体S-腺苷甲硫氨酸的合成。为研究S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在盐胁迫条件下的响应和功能,以玉米甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参基因,通过半定量RT-PCR法分析玉米SAMS基因在盐胁迫条件下的表达模式。结果表明,玉米SAMS基因家族4个成员(SAMS1、SAMS2、SAMS3和SAMS4)在正常生长(对照)和盐胁迫条件下都表达,对照根茎中的表达量大于叶中。SAMS1受盐胁迫后,茎中表达量降低,而叶中表达量略有增加,根中无明显变化。SAMS2和SAMS4受盐胁迫明显诱导,而SAMS3似乎不受盐胁迫诱导,处理植株与对照株相比均无差异。说明玉米SAMS基因家族的4个基因在表达模式上存在差异,推测在功能上存在分工的不同。

大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达

应用PCR技术从E.coli JM 109中扩增出长约1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，将其插入高表达载体pET11c的NdeI和BamHI位点中，转化E.coli BL 21 (DE3)。SDS-PAGE和薄层扫描结果表明，重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达量占菌体总可溶性蛋白含量的58.3%。酶活测定结果表明，重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活力比宿主菌高7倍。

S-腺苷甲硫氨酸的细胞生物化学功能及其开发应用研究

综述了生物体内一种重要的代谢中间体S-腺苷甲硫氨酸的生物学功能,并介绍了其生产制备和临床应用的进展。