离子交换法分离S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

采用离子交换法对酶法合成的S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)进行了分离纯化.研究了QSephroseFF阴离子交换树脂对S-Bzl-GGC的吸附等温线,很好地符合Sips吸附等温线模型.考察了pH值、洗脱梯度、流速和进样量等条件对纯化效果的影响,建立了一套基于QSephroseFF阴离子交换树脂的纯化方案.结果表明,在pH8.2、洗脱梯度0～30%B(Tris-HCl缓冲液+1mol/LNaCl)12mL、流速2mL/min、进样量500μL的优化条件下,经一步分离,产物纯度可达98.5%,经1H-NMR鉴定产物结构正确.

酶法制备S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的动力学模型

以Bacillus subtilis NX-2产γ-谷氨酰转肽酶(GGT)为催化剂,以L-谷氨酰胺(L-Gln)为γ-谷氨酰基供体,S-苄基-L-半胱氨酸(S-Bzl-Cys)为受体,催化合成了S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)。在反应机理分析的基础上,建立了定量描述该过程的动力学模型,模型计算值和实测值能较好吻合,平均相对误差为5.57%。通过模型分析得知,供体浓度的增加有利于转肽反应,但更多的是自转肽反应;受体浓度增加对提高转肽产物S-Bzl-GGC有一定的作用,对自转肽反应几乎没有影响;酶含量增加提高了反应速率,但不提高转肽产物的最大浓度。

化学酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

以Bacillus subtilisNX-2产γ-谷氨酰转肽酶为催化剂,以L-谷氨酰胺和S-苄基-L-半胱氨酸为底物,利用转肽反应合成了S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸,考察了反应时间、初始酶浓度、供体/受体比以及投料方式等条件对反应过程的影响。结果表明,在L-谷氨酰胺浓度为20 mmol/L,S-苄基-L-半胱氨酸浓度为20 mmol/L,酶浓度为0.0208 U/mL以及pH 9条件下,于40℃水浴中反应3 h,S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸得率为5.14 mmol/L,对谷胺酰胺的转化率为25.7%。采用分批投料方式可有效提高谷氨酰供体转化率。S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸以三氟甲磺酸脱除苄基保护基,经RPC纯化后可得产物GGC,产物纯度为91.2%,收率为75.7%。

^(15)N标记S-苄基-L-半胱氨酸含量及其同位素丰度检测

建立了一种测定发酵液中15N标记S-苄基-L-半胱氨酸(SBC)含量的高效液相色谱法(HPLC),该方法采用Cosmosil C18(5μm,150 mm×4.6 mm)色谱柱为分离柱,2,4-二硝基氟苯为衍生剂,0.05 mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH=6.5,含10 mL/L N,N-二甲基甲酰胺)与V(乙腈)∶V(水)=3∶1为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长为350 nm,柱温为30℃;并采用微量高温燃烧-质谱法对15N标记SBC样品的同位素丰度进行了检测。结果显示,SBC浓度为0.2~1.0 g/L时,与其峰面积呈良好的线性关系,y=3×106x-4.16×104,R2=0.998 6,平均加标回收率97.30%,检测限为3.95×10-4g/L,测定结果的相对标准偏差为0.55%;15N标记SBC丰度检测时,最小称样量为2 mg,最佳反应温度为530℃,反应时间为3 h;15N丰度测定值的相对标准偏差为0.17%。

S-苄基-L-半胱氨酸的合成

由溴化苄和L-半胱氨酸直接合成S-苄基-L-半胱氨酸,通过正交试验及统计分析,检验了各影响因子的显著性,确定了最佳工艺条件为:反应时间2.5h,反应温度45℃,原料配比n(溴化苄):n(L-半胱氨酸)=1:1。在此条件下反应,摩尔产率可达到95%。

固定化γ-谷氨酰转肽酶催化合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

以环氧基树脂EupergitC250L为载体对B.subtilisNX-2GGT进行了共价固定化。固定化酶的最适作用pH为9.0,最适作用温度为60℃。固定化酶的热稳定性和贮存稳定性均较游离酶有显著的提高,经100d20个批次转化后,固定化残余酶活仍能保持初始值的80%左右。以固定化酶为催化剂,在反应条件为L-谷氨酰胺(Gln)20mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-Bzl-cys)20mmol/L、酶浓度0.0375U/mL和pH9.0条件下,40℃水浴反应22h,转肽产物S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)得率为4.3mmol/L,较游离酶提高了11.96%。S-Bzl-GGC经酸解脱除保护基后可得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸,产物纯度可达94.1%。

用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽

S 苄基 谷胱甘肽是合成谷胱甘肽的一种重要前体化合物。以L 谷氨酰胺为供体 ,S 苄基 半胱氨酰甘氨酸为受体 ,用BacillussubtilisNX 2的γ 谷氨酰转肽酶催化进行转肽反应 ,合成得到S 苄基 谷胱甘肽。该化合物进行了质谱及核磁共振分析 。

有序介孔TiO_2固载γ-谷氨酰转肽酶催化合成S-bzl-γ-Glutamyl-L-Cysteine

以有序介孔TiO2(OM-TiO2)为载体对B.subtilis NX-2GGT进行吸附固载.圆二色光谱分析和活性位点滴定结果表明,固定化前后酶的二级结构和活性位点数变化很小,固定化后GGT对供体的亲和力及转肽反应催化常数均有不同程度下降,但固定化酶对产物的亲和力有明显提高.固定化后GGT的热稳定性和pH稳定性均较游离酶有显著提高,固定化酶稳定性良好,经10批次转化后,固定化催化活性仍保持74%.以固定化GGT为催化剂,在L-谷氨酰胺(L-Gln)5mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-bzl-cys)15mmol/L、酶浓度0.062U/mL和pH9.0条件下,40℃水浴反应5h,产物浓度为1.2mmol/L.

高效液相色谱法测定1，4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸原料及制剂中的有关物质

目的建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定1,4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸原料及注射用灭菌粉末中4种有关物质。方法色谱柱:Supelcosil LC-SCX强阳离子交换色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:0.1mol·L-1甲酸铵溶液(用甲酸调节pH值至2.8),柱温:30℃,流速:1.0mL·min-1,检测波长:260nm。结果1,4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸峰与各杂质峰均能良好分离。杂质腺苷、腺嘌呤、S-腺苷-L-高半胱氨酸和甲硫腺苷的浓度分别在0.96～19.27,0.95～18.93,1.03～20.64和2.11～42.16μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,回收率分别为100.6%,100.1%,98.2%和99.3%,RSD分别为1.3%,0.8%,0.5%和1.1%(n=12)。结论该方法灵敏、准确,专属性好,可用于1,4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸原料和制剂中有关物质的检查。

大蒜泥均相反应中S-烯丙基-L-半胱氨酸生成的动力学分析

为了利用大蒜内源γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTP）高效生产S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）,首先调查了大蒜泥均相反应中液料比、Ca^2＋浓度对SAC收率和γ-GTP活力的影响,然后对SAC生成进行了动力学分析。实验结果表明,Ca^2＋浓度为5 mmol/L时,初始γ-GTP活力达到最大值12.7 mU/g。最终SAC收率随着初始γ-GTP活力的增加呈线性增加。在液料比8、温度37℃、Ca^2＋浓度5mmol/L、反应时间8 h的条件下,SAC收率达到最大值793.4μg/g-DM。在料液比8、温度20-37℃、Ca^2＋浓度0-10 mmol/L的范围内,SAC生成反应为一级反应,反应速率常数与温度的关系符合Arrhenius方程。当料液Ca2＋浓度从0增加到5 mmol/L时,SAC生成反应的活化能从80.3 kJ/mol下降到最小值70.9 kJ/mol。动力学分析为把握大蒜泥均相反应中SAC的生成过程提供了理论依据和技术数据。

芽胞杆菌培养上清赖氨酸含量分析及高产赖氨酸突变株的筛选

通过传统分离培养法从动物肠道分离得到112株芽胞杆菌,其培养物通过离心过滤后采用氨基酸全自动分析仪对分离得到的100多株芽胞杆菌进行上清氨基酸分析,采用打孔法测定芽胞杆菌对大肠杆菌O8株的抑制效果,通过紫外诱变和S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸筛选对菌株进行选育。结果发现,不同芽胞杆菌菌株产赖氨酸能力相差较大,其中产赖氨酸水平高、抑菌性好的菌株枯草芽胞杆菌PA105,上清赖氨酸水平超过0.3g/L。将枯草芽胞杆菌PA105进行紫外诱变和AEC筛选,获得产赖氨酸高且抗菌的突变菌株枯草芽胞杆菌PL83,上清赖氨酸水平达到0.582g/L,几乎比常规菌株提高了1倍。

高氧暴露对早产鼠肺组织HO-1和GCLC表达的影响

目的 探讨高浓度氧暴露对新生早产大鼠肺组织中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)动态表达的影响。方法 受孕21d大鼠行剖宫产取出早产鼠80只,喂养1d后随机分为空气组和高氧组。空气组早产鼠放置在室内常压空气中饲养,高氧组早产鼠放置在同一室内常压氧箱中(氧浓度85%~95%)饲养,分别于第1、4、7、10、14天,每组取8只大鼠,采集两组早产鼠肺组织标本。采用苏木精-伊红染色法检测两组早产鼠不同时间点肺组织结构的病理变化;采用Westernblot技术和RTqPCR检测两组早产鼠不同时间点肺组织HO-1和GCLC蛋白及mRNA的表达变化。结果 与空气组相比,高氧组早产鼠体重下降显著(P<0.05)。与空气组相比,高氧组早产鼠肺组织病理切片显示肺组织结构紊乱、肺泡间隔增宽、肺泡数目减少和肺泡简单化。高氧组早产鼠肺组织中HO-1mRNA相对表达量在第7天时低于空气组,在第10、14天时高于空气组(P<0.05)。高氧组早产鼠肺组织中GCLCmRNA表达量在第1、4、7天时低于空气组,在第10天时高于空气组(P<0.05)。与空气组比较,高氧组早产鼠肺组织中HO-1蛋白表达水平在各时间点均升高;除第1天外,GCLC蛋白表达水平在其他各时间点均升高(P<0.05)。结论 高氧暴露导致早产鼠生长发育迟缓、肺发育阻滞。早产鼠肺组织HO-1和GCLC蛋白及mRNA的表达变化可能与高氧暴露导致早产鼠肺损伤发病过程相关。

HPLC测定吸入用乙酰半胱氨酸溶液中的异构体

目的采用HPLC法测定乙酰半胱氨酸溶液中异构体的含量。方法参照氨基酸类物质柱前衍生的方法,以(R)-(+)-α-甲基苄基异氰酸酯为衍生化试剂,采用CHIRALPAK IC手性色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为正己烷-无水乙醇-三氟乙酸(90∶10∶0.1),流速1.2 mL·min^-1,检测波长215 nm,进样量10μL。结果1.514~12.613μg·mL^-1乙酰半胱氨酸异构体衍生物与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9998);最低检测限为5.047 ng,乙酰半胱氨酸与异构体衍生物的分离度良好。结论所用方法可用于测定乙酰半胱氨酸中的异构体。

大蒜烯丙基硫化物的分离鉴定及抗氧化性

为了研究大蒜烯丙基硫化物的抗氧化活性,该文利用离子交换层析与制备液相技术从大蒜中分离得到S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine,SAC)、S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-allyl-L-cysteine sulfoxide,ACSO)和γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸(γ-L-glutamyl-S-allyl-L-cysteine,GSAC)3种水溶性烯丙基硫化物。分离产物利用高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱联用(high performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass/mass spectrometry,HPLC-ESI-MS/MS)、核磁共振氢谱(proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)和核磁共振碳谱(carbon-13 nuclear magnetic resonance,13C NMR)技术及比旋光度检测方法鉴定,并与合成标准品比对分析确定。同时,该文以具有半胱氨酸结构的还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)为参照测定了SAC、ACSO、GSAC的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力及铁离子螯合能力。结果表明,SAC和GSAC对DPPH自由基的清除率较高(73.55%,72.68%)且与GSH(71.14%)无显著性差异(P<0.05);SAC和ACSO对铁离子的螯合率较高(81.21%,79.18%)且与GSH(78.13%)无显著性差异(P<0.05),尤其是GSAC对铁离子螯合率(92.76%)显著性高于GSH(P<0.05),证实了3种硫化物均具有很好的抗氧化性能。研究结果进一步解释和阐述大蒜硫化物的螯合能力,进而为大蒜硫化物以抗氧化为基础的其他功能活性研究提供参考。

慈姑多糖对异烟肼/利福平联用致HepG2细胞损伤HO-1和GCLC的影响

目的:研究慈姑多糖(SSP)对异烟肼(INH)和利福平(RFP)联用致HepG2细胞损伤中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)酶含量、基因及蛋白表达影响。方法:采用ELISA检测HepG2细胞中HO-1和GCLC含量变化;采用定量RT-PCR技术检测HepG2细胞中HO-1、GCLC mRNA的表达;采用Western Blot法检测HepG2细胞中HO-1和GCLC蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,模型组HepG2细胞中HO-1和GCLC含量、mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.05);与模型组比较,SSP最佳给药组中HO-1和GCLC mRNA、蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:SSP可能通过促进HepG2细胞中HO-1及GCLC含量、mRNA及蛋白的表达,发挥其对INH/RFP联用致肝损伤的保护作用。

大蒜绿变反应及其抑制技术研究进展

绿变是大蒜加工过程中经常发生的问题之一。根据近年来的文献报道,阐述了大蒜绿变的反应过程,并介绍了γ-谷氨酰-S-烯基-L-半胱氨酸向S-烯基-L-半胱氨酸的转化反应、S-烯基-L-半胱氨酸亚砜向硫代亚磺酸酯的转化反应、γ-谷氨酰转肽酶和蒜氨酸酶的特性、以及酶法绿变抑制技术。这些转化反应揭示了大蒜绿变机理,而酶法绿变抑制技术为解决大蒜绿变问题提供了一种有效方法。

血清AFU、ALP、GGT、CHE和Hcy联合检测对原发性肝癌的诊断价值

目的探讨血清AFU、ALP、GGT、CHE和同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对原发性肝癌的诊断价值。方法对213例原发性肝癌、85例良性肝病和50例健康人血清中AFU、ALP、GGT、CHE和Hcy水平进行检测分析。结果原发性肝癌患者血清AFU、ALP、GGT、CHE和Hcy水平与良性肝病组及正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);联合检测的敏感性和诊断准确性均较高。结论联合检测AFU、ALP、GGT、CHE和Hcy对原发性肝癌的诊断有重要价值。