硫代反义寡核苷酸体外对HDV的抑制作用

目的观察硫代反义寡核苷酸 (S- ASODN)体外对 HDV的抑制作用。方法在 HDV/ HBV感染人胎肝细胞中加入不同浓度的针对 HDV Stem 区 6 84～ 6 98位核苷酸的 15聚 S- ASODN,分别采用 EL ISA和斑点杂交法检测上清液中 HDAg和细胞中 HDV RNA。结果 HBs Ag、HDAg在感染后第 2 d至第 16 d均可测出 ,以第 4d至第 12 d达高峰。加入 S- ASODN(2、4、6 μmol/ L)后 2 d,肝细胞中 HDV复制受到抑制 ,培养上清中 HDAg分泌量也减少 ,其抑制率呈剂量依赖关系 ;在同等剂量时(4μmol/ L) ,S- ASODN作用 2 d、4d、6 d,对 HDV抑制率大至相同。结论 HDV在原代培养人胎肝细胞中能稳定复制和表达至少达 12 d;S- ASODN能有效抑制 HDV/ HBV感染人胎肝细胞中 HDV复制与表达。本研究为进一步在动物体内研究 S- ASODN抗HDV作用和向临床过渡提供了有益的实验依据。

硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸抗HBV细胞的实验研究

针对ＨＢＶ的５个基因位点作为靶序列，设计合成硫代反义寡聚核苷酸（Ｓ－ａｓＯＤＮ）．应用ＥＬＩＳＡ方法、ＭＴＴ比色法、电子显微镜等手段，观察Ｓ－ａｓＯＤＮ对ＨｅｐＧ２２２１５细胞ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ抗原的表达，及细胞的毒性、细胞形态和超微结构的影响．结果显示不同靶位点的Ｓ－ａｓＯＤＮ对ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达都有显著的抑制作用，且表现为序列特异性、剂量相关性、联合协同性和一定的抗核酸酶性，在浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ时，对细胞无明显杀伤作用，对细胞的超微结构无显著的改变．结果提示Ｓ－ａｓＯＤＮ有望发展为抗ＨＢＶ的有效药物，但靶序列的选择、透细胞膜性及联合用药配伍等仍值得进一步研究和解决．

硫代反义寡脱氧核苷酸在树体内对HDV复制与表达的抑制作用

目的：在树（Ｔｕｐａｉａ）体内观察硫代反义寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＡＳＯＤＮ）对ＨＤＶ复制、表达的抑制作用。方法：树同时接种ＨＢＶ阳性血清０．１ｍｌ、ＨＤＶ阳性血清０．３ｍｌ后，将１６只ＨＤＶ／ＨＢＶ感染成功的树随机分为两组，给药组８只树按每只每次经尾静脉注射Ｓ－ＡＳＯＤＮ３ｍｇ，隔日１次，共７次。对照组中２只注射等量生理盐水，另６只不作处理。注射后５、１０、１５、２５ｄ取血及肝组织采用免疫组化、斑点杂交及原位杂交法检测ＨＤＶＡｇ及ＨＤＶＲＮＡ。结果：于注射结束时（１５ｄ）给药组有７只树肝内ＨＤＶＡｇ及ＨＤＶＲ－ＮＡ转为阴性，对照组８只树中仅１只转为阴性。停止使用Ｓ－ＡＳＯＤＮ１０ｄ后，给药组２只阴转树肝内又可检出ＨＤＶＡｇ和ＨＤＶＲＮＡ，对照组仍有７只可检出。结论：Ｓ－ＡＳＯＤＮ在树体内能有效抑制ＨＤＶ复制及表达，但作用并不完全，可能与用药剂量不足。

Skp2反义寡核苷酸对K562细胞生长和增殖的影响

背景与目的:泛素-蛋白酶体途径是真核细胞中选择性降解短寿命蛋白的重要途径。S期激酶相关蛋白2(S-phasekinase-associatedprotein2,Skp2)是此途径中的一个重要组件,它是决定细胞周期素依赖性激酶抑制因子p27降解的关键蛋白。近年来,在实体瘤的研究中发现Skp2是癌蛋白,能促进癌细胞的细胞周期进展,但在白血病细胞恶性增殖中所起的作用还未见报道。本实验旨在研究Skp2反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)对白血病细胞系K562细胞生长和增殖的影响及其可能的机制。方法:Skp2反义寡核苷酸和K562细胞共同培养,通过显微镜下观察、四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察K562细胞生长和增殖,流式细胞术分析细胞周期,逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)和细胞免疫化学测定Skp2mRNA、蛋白及p27mRNA、蛋白的表达。结果:Skp2反义寡核苷酸处理后,K562细胞增殖受抑,细胞周期阻滞于G0/G1期犤Skp2ASODN组(39.7±9.1)%,对照组(31.5±7.3)%,P<0.05犦。Skp2mRNA及Skp2蛋白水平降低;尽管p27mRNA未见改变,但其蛋白水平明显升高。结论:Skp2反义寡核苷酸能抑制K562细胞增殖,这种抑制作用主要是通过调控泛素-蛋白酶体途径,进而影响细胞周期进展而实现的。

HCV 5'NCR调控抑制活性的反义寡核苷酸的筛选

目的寻找高效特异的新型抗HCV药物,探讨针对HCV基因的硫代修饰反义寡核苷酸（S－ASODNs）最佳作用靶序列。方法参考HCV5＇NCR计算机预测的二级结构图,设计合成了15条S-ASODN、3条正义寡核苷酸及1条随机序列，采用HCV5＇NCR调控荧光素酶基因的瞬时表达系统，将S－ASODN与pHCV－neo4共转染，通过荧光素酶活性表达高低，反映S－ASODN对HCV调控基因的抑制活性。结果5条S－ASODN即HCV65、HCV279、HCV363、HCV349及HCV352在25～100nmol／L浓度范围内，对HCV调控基因具有特异性的剂量依赖性抑制活性。当浓度为100nmol／L时，这些ASODN的抑制率可达80％以上，IC_(50)值提示HCV363的抑制活性最强。通过阴性对照实验包括正义寡核苷酸、随机序列及不含HCV序列的靶载体pGL3提示ASODN仅存在轻度非特异性作用。此外，实验结果还提示不同作用靶位的ASODN之间具有一定的协同作用。结论HCV5＇NCR第二茎环结构Ⅱa、第三茎环结构Ⅲd和翻译起始区可能是ASODN作用的重要靶序列。