微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的对微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因进行克隆、表达和反应原性分析。方法以微小隐孢子虫总RNA逆转录的cDNA为模板,克隆S-dsRNA基因,并转化至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET-28a(+)-S,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白与鼠抗微小隐孢子虫阳性血清的反应原性。结果 PCR和双酶切鉴定表明,重组质粒pET-28a(+)-S构建成功。SDS-PAGE结果显示,37℃下经1mmol/L IPTG诱导4h,重组蛋白表达量最大。重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为37000,与预期大小一致,重组蛋白约占蛋白总量的72.6%。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能识别抗微小隐孢子虫阳性鼠血清。结论微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因表达成功,重组蛋白具有反应原性。

腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA对马铃薯甲虫幼虫毒力测定

【目的】测定已验证的腺苷高半胱氨酸水解酶基因的dsRNA对马铃薯甲虫各龄期幼虫的毒力,为RNA干扰在马铃薯甲虫防治中的具体应用条件。【方法】采用饲喂法,将不同剂量马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA(ds SAHase)导入马铃薯甲虫体内,运用线性回归方法测算各龄期LC50;观测饲喂后成虫的产卵数,解剖观察雌成虫卵巢发育情况。【结果】ds SAHase对马铃薯甲虫各龄期幼虫1龄,2龄,3龄和4龄的LC50分别为2.341、2.552、3.450和4.968μg/m L。【结论】ds SAHase对马铃薯甲虫幼虫具有显著致死作用、拒食作用以及抑制生长发育作用,各龄期幼虫的毒力随龄期增长而降低,其中对1、2龄幼虫毒力与对3、4龄幼虫毒力差异显著。

储存条件对表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA的大肠杆菌生物活性的影响

【目的】将RNA干扰应用于害虫防治领域,通过饲喂表达ds RNA的转基因植物或表达ds RNA的细菌,可沉默特定基因进而控制害虫,为农业害虫防治开辟一个新领域。而表达ds RNA的细菌能否有效储存是决定此项技术实际应用的关键。【方法】用﹣20℃冻存的表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)ds RNA的大肠杆菌E.coli,饲喂马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)2龄幼虫,检测不同时间储存、灭活与否的活性变化,明确其储存条件。【结果】大肠杆菌﹣20℃储存24 h后生物活性优于新鲜菌,储存48 h后效果减弱,而载体大肠杆菌是否灭活对活性影响不大。【结论】ds RNA大肠杆菌发酵液在﹣20℃条件下可以短暂储存。