小麦蛋白水解物对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)生长的影响研究

该研究对比了小麦蛋白水解物与不同蛋白胨对嗜酸乳杆菌生长的影响,重点从分子质量分布、氨基酸组成等方面解析了小麦蛋白水解物对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)形态、活菌数、冻干存活率的影响。结果表明,小麦蛋白水解物是一种适用于嗜酸乳杆菌培养的有机氮源,同等培养条件下活菌数和冻干存活率高于其他蛋白胨,小麦蛋白水解物中分子质量为2000~5000 Da的组分是促进嗜酸乳杆菌生长的关键营养,含谷氨酰胺、脯氨酸组成的多肽可能是促进嗜酸乳杆菌缩短菌体,活菌数和冻干存活率提高的关键因素。该研究结果可为小麦蛋白水解物在嗜酸乳杆菌生产及其他发酵领域的应用提供一定的基础数据支撑。

响应面法优化嗜酸乳杆菌协同发酵豆粕的条件研究

试验分别利用产α-淀粉酶、蛋白酶、植酸酶以及β-甘露聚糖酶的功能性嗜酸乳杆菌对豆粕进行协同发酵,采用单因素试验研究了菌液接种量、发酵温度、发酵时间、液料比对酸溶蛋白含量的影响。在此基础上经过Box-Behnken设计试验,建立二次回归模型,得到最佳发酵条件为菌液接种量12.3%、发酵时间78.9 h、发酵温度36.8℃、液料比0.9 L/kg。在此条件下发酵豆粕,发酵豆粕的粗蛋白含量比发酵前提高了15.13%,酸溶蛋白含量提高了66.91%,半纤维素含量下降了24.93%,游离氨基酸含量是发酵前的11.62倍,胰蛋白酶抑制剂含量下降了91.68%,脲酶活性下降了95.67%,植酸含量下降了83.87%,发酵豆粕中的活菌数为1.37×10^(10) CFU/g。研究表明,该复合菌株发酵模式能够有效增加豆粕的营养成分,去除抗营养因子,从而提高豆粕的利用率,为发酵豆粕的工业化生产提供参考。

益生菌发酵豆乳中营养成分变化研究

为了提高豆乳的营养价值,分别采用植物乳杆菌和两歧双岐杆菌对豆乳进行单菌种发酵和混合发酵,并对发酵豆乳与未发酵豆乳的蛋白质、小肽及氨基酸含量进行比较。结果表明:与未发酵豆乳相比,植物乳杆菌、两歧双岐杆菌单菌种和混合菌种发酵豆乳蛋白质含量基本保持不变,但单菌种和混合菌种发酵后分子质量为200 ku和80 ku的蛋白质基本被全部降解,小分子质量蛋白条带均有所增加;小肽含量分别增加了19.4%、22.16%和27.12%;氨基酸总含量分别增加了8.22%、10.61%和9.95%。

杜仲水提液对嗜酸乳杆菌生长及发酵产物的影响

制备5种不同质量浓度的杜仲水提液添加到MRS培养基中对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CICC6005进行培养,旨在探究不同质量浓度的杜仲水提液对L.acidophilus CICC6005增殖情况及对发酵过程中胞外和胞内蛋白含量变化的影响,并对其蛋白组分进行分析。发酵所得胞外和胞内蛋白分别用三氯乙酸-丙酮沉淀法和试剂盒法获得,采用Sephadex G-100凝胶层析分离技术对胞外和胞内蛋白分离纯化,用二喹啉甲酸法和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测得各组分蛋白的含量及分子质量。结果显示:当培养基中添加的杜仲水提液质量浓度为0.125 0 g/m L时,对菌体增殖有明显的促进作用,菌体生物量最大(4.38×108 CFU/m L),同时在此质量浓度时菌体胞外和胞内蛋白含量也达到最大值;胞外和胞内蛋白经过Sephadex G-100凝胶层析分离后均得到2个明显的蛋白峰,胞外蛋白两组分分子质量分别为67、31 ku,胞内蛋白两组分分子质量分别为57、17 ku。综上,添加适宜质量浓度的杜仲水提液对L.acidophilus CICC6005的增殖起到了一定的促进作用,并对其发酵产物组成产生了一定的影响。

嗜酸乳杆菌发酵制备苜蓿叶蛋白的研究

以"肇东"紫花苜蓿干草为实验材料,利用嗜酸乳杆菌发酵沉降提取苜蓿叶蛋白,研究嗜酸乳杆菌的生长规律、并筛选高产酸嗜酸乳杆菌,确定苜蓿叶蛋白的等电点;研究发酵时间、接种量、料液比3个因素对叶蛋白得率的影响,确定发酵法提取苜蓿叶蛋白的最佳工艺。结果表明:pH3.0～3.7为苜蓿叶蛋白的最佳沉降范围;最佳发酵条件参数为:发酵时间11h、料液比1:20、接种量为107个/mL;在该条件下,制备的苜蓿叶蛋白粗蛋白含量为45.08%。

以共附生乳酸菌发酵虾头、虾壳

旨在从虾头中分离共附生乳酸菌,并用以发酵虾头、虾壳回收蛋白质和甲壳素。经筛选得到1株在虾头、虾壳中易于生长,产酸能力强的乳酸菌,经鉴定为嗜酸乳杆菌,命名为SW01。实验进一步确定了以SW01发酵虾头、虾壳的适宜条件,即向虾头、虾壳中添加15%葡萄糖,固液比1∶0.5,初始pH为7.0,于40℃发酵72 h,在此条件下,发酵液pH值低至3.50,蛋白质脱除率达94.8%,发酵残渣中矿物质含量仅为0.77%,达到食品级甲壳素纯度要求。通过该方法可同时回收虾头、虾壳中的蛋白质和甲壳素;基本无废渣、废液排放,避免了环境污染。

乳清蛋白酶解物促嗜酸乳杆菌增殖作用研究

利用胃蛋白酶水解乳清蛋白,获得酶解产物的优化工艺条件是pH值为2.2,水解温度为65℃,底物质量浓度为2g/100mL,酶与底物比为7%,其蛋白水解度为12.51%。乳清蛋白水解物与经过超滤和凝胶过滤后的分离物对嗜酸乳杆菌B有较好的增殖作用,其中分子量1000D以下的酶解产物增殖效果最为显著。质谱分析证实该段水解产物是分子量集中在213.2～956.9D之间的寡肽和氨基酸复合物,可使嗜酸乳杆菌B活细胞数量提高一个对数级。显然,应用廉价乳清蛋白水解产物作为培养基质可以提高嗜酸乳杆菌B的细胞数量。

嗜酸乳杆菌NCFM表层蛋白的提取及其与菌体酸和胆盐耐受及粘附性能的关系

对嗜酸乳杆菌NCFM表层蛋白(SLP)的氯化锂(LiCl)提取方法进行了优化,通过SDS-PAGE验证,确定了效率最高的提取条件,即用5mol/L LiCl在35℃处理菌体20min,且提取SLP后,菌体不会失活,8h后重新生成的SLP达到峰值。利用SLP能够再生的性质,分析了SLP与菌体耐酸耐胆盐性能,以及菌体对肠上皮细胞HT-29粘附能力的关系。实验结果显示:随着SLP的再生,去除SLP的菌体酸存活率由0h的52.5%上升到8h后的85.9%,胆盐存活率由0h的43.4%上升到8h后的81.8%,菌体对HT-29细胞的粘附指数从0h的0.33上升到8h后的18.54。SLP再生过程中菌体对酸和胆盐的耐受力和对HT-29细胞的粘附力均有恢复,因此说明SLP的完整对嗜酸乳杆菌NCFM在消化中存活力有重要影响。

嗜酸乳杆菌细胞壁提取物对致病性大肠杆菌粘附鸡肠纹状缘膜的影响

为研究嗜酸乳杆菌细胞壁提取物对致病性大肠杆菌(E.coli)粘附鸡肠纹状缘膜的影响,本实验以雏鸡小肠纹状缘膜为模型,以嗜酸乳杆菌和鸡致病性E.coli O78为研究对象,提取嗜酸乳杆菌表层蛋白、肽聚糖及E.coli O78菌毛,雏鸡小肠纹状缘膜,采用固相粘附试验和生物素标记法从分子间相互作用的关系评价了嗜酸乳杆菌细胞壁提取物对菌毛粘附的抑制作用,结果表明:表层蛋白和肽聚糖对菌毛粘附具有明显的抑制作用,呈浓度依赖性抑制菌毛与纹状缘膜的结合,具有竞争性拮抗作用,这主要是由空间占位造成的。肽聚糖的抑制作用相对较小。

几种乳酸菌S-层蛋白的普查以及slp基因的克隆与序列分析

从内蒙古传统发酵乳制品中分离的几种乳酸菌,包括干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧乳杆菌和嗜酸乳杆菌标准株(L.acidophilus ATCC4356)等为实验材料,应用SDS-PAGE方法和PCR方法分别进行S-层蛋白(S-layers pro-tein,SLP)的普查和slp基因的检测。结果表明:在各种乳酸菌中,经SDS-PAGE电泳方法检测,只有植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和其标准菌株的样品中出现膜外蛋白的可疑条带,大小为44～66ku之间,与文献报道的slp基因表达产物大小范围是一致;经PCR方法检测,只有嗜酸乳杆菌和其标准菌株L.acidophilus ATCC4356中扩增出slp基因可疑条带,其大小约为1 300 bp。并对嗜酸乳杆菌slp基因进行克隆、基因序列测序和分析。

酪蛋白水解物对发酵乳中乳酸菌增殖作用的研究

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）是乳酸菌家族中极为重要的益生菌之一，已广泛地被人们所接受，因此，研究利用该菌于发酵酸乳制品中具有重要意义。本文采用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）共发酵技术，较系统地研究了酸奶发酵的最佳条件，确定了酪蛋白水解物对嘈酸乳杆菌增殖有明显的促进作用并可提高其生存能力。实验结果表明，嗜酸乳杆菌：嗜热链球菌=2：1，37℃培养时，酸奶凝乳时间最短，产品质地最好。同时，水解度为25．0％酪蛋白酶解物对嗜酸乳杆菌增殖有明显的促进作用，添加2g／L，37℃培养，2h后即可凝乳，所得产品质地细腻，酸度达到80DT，终产品中嗜酸乳杆菌活菌数达到10^9cfu／mL。

嗜酸乳杆菌胞外蛋白调控MAPK和PI3K-AKT信号途径关键蛋白活化水平

探讨并揭示嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CICC6005分泌的相关蛋白质促进肠道健康及分子机制具有重要研究价值。本实验在确定了L.acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29结肠癌细胞增殖的基础上,进一步探讨67 ku和37 ku的胞外蛋白通过何种途径发挥抑制结肠癌细胞增殖。研究以HT-29细胞作为靶细胞,用丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B,PI3K-AKT)信号通路为考察对象,以Western Blotting为手段,分析两个通路中关键的靶点蛋白p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷酸化p38(phosphorylated p38,p-p38)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)、磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated AKT,p-AKT)、PI3K的表达水平,以探讨并阐述源于L.acidophilus CICC6005胞外蛋白调控结肠癌细胞增殖状况的分子机制。结果表明,不同质量浓度的67 ku和37 ku胞外蛋白分别作用HT-29细胞一定时间后,两种胞外蛋白均具有下调两个信号通路途径中p-ERK1/2、p-p38、p-AKT、PI3K蛋白的表达,且存在浓度依赖关系;但对p-JNK、ERK1/2、p38、JNK蛋白的表达没有影响。因此,源于L.acidophilus CICC6005分泌的37 ku和67 ku胞外蛋白表现出显著的抑制HT-29细胞增殖的功能,其机制可能与调控MAPK和PI3K-AKT两个信号通路中几个关键的靶点蛋白的活化水平相关。该研究结果提示,食用嗜酸乳杆菌其分泌的胞外蛋白质将达到维护肠道健康的目标。

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的克隆与表达

利用分子生物学方法对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株的亚油酸异构酶基因进行克隆与表达.培养菌体后提取总DNA,用PCR法扩增其亚油酸异构酶基因,再将其克隆到pET30a载体上,转入到大肠杆菌BL21株中表达,在低温下诱导表达出重组蛋白,并用Ni2+金属鳌合层析对重组蛋白进行分离和纯化.通过实验,得到了亚油酸异构酶的基因,成功转入到载体中,表达出了可溶性的重组蛋白,并对其进行了纯化.实验表明,在原核细胞中可以表达出可溶性重组亚油酸异构酶,以200mmol/L的咪唑洗脱液进行洗脱可以获得目标蛋白.

乳酸杆菌S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞的协同作用

设计3种黏附试验分别研究了嗜酸乳酸杆菌和S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞的影响。结果显示:在置换试验中,嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞没有影响;但在排斥试验和竞争试验中,嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白均对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞产生明显的协同作用,在排斥试验中嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白分别增加产肠毒素大肠杆菌的黏附数量95.23%±4.22%(P<0.01)和352.30%±2.26%(P<0.01),在竞争试验中分别增加389.06%±3.35%(P<0.01)和55.57%±5.81%(P<0.05);并且S-层蛋白在排斥试验中,对产肠毒素大肠杆菌的协同黏附作用大于竞争试验中的协同黏附作用。可见,乳酸杆菌对产肠毒素大肠杆菌的协同黏附作用关键在于S-层蛋白,S-层蛋白可能起到"连接桥"的作用。

绿色荧光蛋白穿梭载体的构建及其在嗜酸乳杆菌中的应用

为深入研究嗜酸乳杆菌的作用机理,以温敏型穿梭载体pSET4s为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)和嗜酸乳杆菌上、下游同源臂插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pSET4s-P1-GFP-P2。利用电转化方法将穿梭表达载体pSET4s-P1-GFP-P2转化入嗜酸乳杆菌,通过抗性和温度双重筛选获得能稳定表达GFP的重组嗜酸乳杆菌,将Western blotting和荧光显微镜观察验证的重组菌命名为ΔMG6243(GFP)。利用荧光显微镜观察和平板计数的方法对重组菌进行遗传稳定性和生物学特性研究。结果显示,重组菌在蓝光激发下可见明显绿色荧光,连传10代仍可见明显荧光,与野生菌相比,其生长特性、酸碱盐耐受性均无显著差别。结果表明,本试验已成功构建稳定表达GFP基因的重组嗜酸乳杆菌,利用温敏型穿梭载体pSET4s实现了外源基因在嗜酸乳杆菌中非抗性、整合型表达,为嗜酸乳杆菌基因重组菌的构建奠定了基础,同时GFP的标记作用也为嗜酸乳杆菌在动物体内分布、定植规律和作用机理创造了可行的条件。

嗜酸乳杆菌S-层蛋白联合抗生素对Escherichia coli和Staphylococcus aureus的抑制作用研究

旨在检测嗜酸乳杆菌S-层蛋白以及S-层蛋白与抗生素联用对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用。采用液体发酵培养法获得嗜酸乳杆菌菌体,LiCl法提取S-层蛋白粗提物,凝胶过滤层析法纯化S-层蛋白,分别用E.coli和S.aureus处理Caco-2细胞2 h后,考察S-层蛋白在不同浓度和不同作用时间条件下对E.coli和S.aureus的抑制作用,并考察S-层蛋白联合抗生素对E.coli和S.aureus的抑制作用,实验分组:(1)空白对照;(2)嗜酸乳杆菌组;(3)S-层蛋白组;(4)抗生素组;(5)嗜酸乳杆菌+抗生素组;(6)S-层蛋白+抗生素组。结果显示,液体发酵得到嗜酸乳杆菌菌体,提取并纯化得到S-层蛋白;S-层蛋白对E.coli和S.aureus有很好的抑制效果,具有浓度依赖性,高浓度下抑制率达到42.2%和31.7%,差异极显著(P<0.01),且在E.coli和S.aureus作用的短时间内干预效果明显,0 h时的抑制率分别达到59.3%和48.4%;S-层蛋白联合抗生素的抑菌率分别达到81.7%和79.3%,差异极显著(P<0.01),效果优于单独使用抗生素。嗜酸乳杆菌S-层蛋白具有较强的抑菌作用,可以与抗生素联用,有望开发称为一种新型的抗菌药物。

以嗜酸乳杆菌发酵虾头虾壳回收蛋白质和甲壳素的研究

利用嗜酸乳杆菌发酵虾头、虾壳,结合虾头、虾壳中内源蛋白酶的自溶作用,回收蛋白质和甲壳素。研究了影响发酵的因素并优化了发酵条件,分析了用稀盐酸脱除粗甲壳素(即发酵残渣)中的矿物质,制备食用级甲壳素的条件。研究结果表明,添加15%葡萄糖,固液比1∶2.5,接种量15%,初始pH值6.5,于40℃发酵48 h,得到的虾头、虾壳发酵液pH值低至3.79,蛋白质水解度达到21.9%;蛋白质回收率达到95.2%,发酵残渣(粗甲壳素)中仅残留2.71%矿物质,达到工业级甲壳素的纯度要求;以稀盐酸浸泡处理粗甲壳素,当浸泡温度为50℃,浸泡时间为1.5 h,粗甲壳素脱矿物质的效果最好,甲壳素中仅残留0.2%矿物质,达到食用级甲壳素的纯度要求。

嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因表达载体的构建与蛋白特性分析

目的构建嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因表达载体并分析其表达蛋白的特性和结构。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因并构建表达载体pMG36e-lacZ,并对构建后的表达载体进行鉴定和表达蛋白进行二维与三维结构分析。结果成功构建了嗜酸乳杆菌ATCC4356-lacZ基因表达载体并分析出了表达的β-半乳糖苷酶二维和三维结构图。结论表达载体的构建和蛋白特性与结构分析结果为后续的蛋白表达和酶生物学特性研究奠定了基础。

嗜酸乳杆菌NCFM双精氨酸分泌信号肽蛋白的预测分析

[目的]对嗜酸乳杆菌NCFM中Tat途径分泌信号肽蛋白进行预测分析。[方法]以嗜酸乳杆菌NCFM基因组序列为对象,采用Signal P4.0、Lipo P1.0、Tat P软件分析该菌株基因组中的双精氨酸途径分泌信号肽蛋白。[结果]嗜酸乳杆菌NCFM中有酶切位点也有motif的Tat途径信号肽蛋白94个。[结论]对嗜酸乳杆菌NCFM中Tat途径分泌信号肽蛋白的预测分析,为进一步分析该菌胞外蛋白的分泌机制打下基础。

嗜酸乳杆菌群双组分信号转导系统

为明确Lactobacillus acidophilus菌群中的双组分信号转导系统的分布及功能，采用HMMER、SMART、TMHMM、ClustalW等生物信息学手段对L.acidophilus菌群中全基因组进行扫描，对其中的双组分信号转导系统进行预测，并进行结构分析及功能预测.结果表明，L.acidophilus菌群中具有5-9个双组分信号转导系统，其中部分TCS系统调控细菌的耐酸、耐胆汁能力及细菌素分泌等益生功能密切相关的性能.